[发明专利]一种有核细胞标识方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术以及法医学领域，尤其涉及适用于单细胞分离检测平台的有核细胞标识方法及其应用。

背景技术

在刑事案件侦破中，很多都需要法医鉴定的介入。多数情况下，现场所能获得的检材上通常都是一些疑难混合检材，与研究用的理想检材相比，突出的问题是所获得的检材中目标细胞数量少，形态变化大，胞核胞浆分界不清，背景复杂。在不进行细胞标识的情况下，这些检材上的目标细胞无法发现或极易被误认，导致不能获得检材细胞的确定DNA分型结果，因此对于这些检材必须通过特定和有效的细胞标识方法来对目标细胞进行识别和分离。为了对目标细胞进行有效识别和分离，目前采用的方法中，对检材细胞进行染色后实施PCR扩增是必需的操作过程，但面临的问题是，因染料对PCR扩增具有一定程度的抑制，对于成功捕获的检材细胞最终仍得不到良好的分型结果，不能满足案件分析的需要。

虽然国内外学者对基于单细胞分离检验技术平台的细胞标识方法进行了多方面的研究，但都没有解决染料对PCR扩增产生明显的抑制的问题。有报道研究人员利用显微捕获仪进行单个细胞DNA样本制备中，采用酸性复红进行细胞悬液染色，通过标识细胞的胞浆来实现对目标细胞的识别，但该实验采用的染料对PCR扩增产生明显的抑制；

也有一些关于利用激光捕获显微切割系统(LCM)从模拟混合精斑样本里分离精子细胞的研究，采用了五种组织学染色法(HE法、CTS法、AO法、Wright氏法、甲基绿法)对精子细胞和阴道上皮细胞进行涂片染色，并对标识效果及PCR扩增抑制程度进行比较，虽然发现HE法和CTS法染色效果相对较好，但两种染色法仍导致一定程度的PCR扩增抑制。

虽然使用上述的染色方法基本可以满足对理想检材的检测，但是对于来自事故或者案件中的微量混合检材，因染料对PCR扩增抑制明显，采用上述染色方法即使获得良好的细胞标识效果，最终的基因分型结果仍然偏差很大。

近年来发展起来的显微操作仪捕获法联合LV-PCR单细胞分离检测平台或激光显微切割法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台，基于显微镜玻片平面印刷的技术，为捕获到的单细胞的微量DNA进行扩增提供了最佳微量反应环境，使单细胞分离检测平台的灵敏度大大提高，理论上讲更加适用于对微量混合检材的扩增分型。针对低体积的扩增体系的检测需要，在提高单细胞分离检测平台灵敏度的同时，对减少后续PCR扩增抑制提出了更高的要求，因此如何降低微量扩增体系中染料的抑制作用，以获得混合检材中有核细胞良好的DNA分型结果成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种有核细胞标识方法，通过对染料种类以及染色时间的确定，在对检材细胞进行有效识别的同时，后续的LV-PCR扩增抑制弱，并能获得良好的DNA分型结果，更适于应用于显微操作仪捕获法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台和激光显微切割法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台，取得提高的DNA分型效率。

本发明进一步还提供了对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的方法，应用于显微操作仪捕获法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台和激光显微切割法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台，达到提高DNA分型的准确性的目的。

本发明提供了一种有核细胞标识方法，该方法包括：

将含上述有核细胞的检材放入含有适量缓冲液的离心管中，振荡离心管使其上的细胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；

将龙胆紫或苏木素加入上述细胞悬液，进行染色；所述龙胆紫的终浓度为0.1～0.5μg/μl，染色时间为2～7分钟；所述苏木素的终浓度为1～7μg/μl，染色时间为3～7分钟；

对上述染色后的细胞悬液中的有核细胞利用显微镜进行观察和识别。

本发明提供的上述有核细胞标识方法的具体实施方案中，龙胆紫的配制和保存方法可以为：将5g龙胆紫晶体加入10ml的95％乙醇中溶解，添加灭菌后的去离子水至100ml，将配好的龙胆紫染液放入棕色瓶密封保存，在1月内使用。当然，也可以按照其他适当方法进行配制和保存。

苏木素的配置方法：将1g苏木素溶于10ml无水酒精中，加热溶解，另将20g硫酸铝钾和200ml蒸馏水放入较大的三角烧瓶中加温并搅拌，待全部溶解后，再倒入苏木素酒精溶液，混合后煮沸1分钟，稍冷却，慢慢加入0.5g红色氧化汞0.5g，改用小火加温，当染液变为紫红色时，将烧瓶浸入冷水中，使染液迅速冷却，冷却后过滤即可使用。