[发明专利]一种利用α-半乳糖苷酶合成α-低聚半乳糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法合成方法，特别是涉及一种利用α-半乳糖苷酶合成α-低聚半乳糖的方法。

背景技术

在动物中，含有α-半乳糖苷结构的低聚糖通常与细胞表面脂类、蛋白质及一些未知的复合糖相结合，α-半乳糖苷结构大多存在于低聚糖的非还原性末端，有着重要的生理功能。其中，两个半乳糖残基通过α-糖苷键连接的α-低聚半乳二糖(α-Galactobiose，α-Gal2)参与了各种基于分子机理的配体-受体相互作用的生理过程如免疫和病原体吸附细胞等重要的生理过程。α-Gal2还可以防止病原体感染、中和毒素、调节免疫系统等功能。由于两个半乳糖残基之间有多种连接方式，因此α-Gal2存在着多种同分异构体，而不同的同分异构体有着不同的功能。α-低聚半乳糖作为一种功能性低聚糖，有广阔的应用前景。

α-半乳糖苷酶与其它的糖苷酶一样都是糖蛋白，能催化很多底物末端的半乳糖的断裂，包括线性底物、有分支的寡糖、多糖以及人工合成的底物。很多动物、植物、微生物都能产生α-半乳糖苷酶，这些酶通常以异构酶的形式存在。不同的微生物产生的α-半乳糖苷酶的最适pH和温度的范围各不相同。α-半乳糖苷酶在食品、饲料及医药工业各方面都具有很重要的应用价值。

目前，α-低聚半乳糖的生产大致分为4种：从天然原料提取、天然多糖水解、化学合成、酶法合成。从天然原料中提取，主要是从豆科植物的种子中提取，现阶段国内外报道的有关提取原料主要有大豆、羽扇豆、豇豆、豌豆等，获得的产物种类较多，难以分离纯化。天然多糖转化产品得率低，产物复杂，不易获得纯品。化学合成法使用大量化学试剂，毒性大，易残留，生产成本高，并且需要繁琐的羟基保护和去保护步骤，在实际生产中不可行。从食品工业角度看，作为一种大量使用的功能性基料，必须考虑原料充足，方便，易得，无毒性，生产成本低等问题，因此，合理的方法是酶法合成。酶法合成主要以半乳糖为底物，通过α-半乳糖苷酶催化合成α-低聚半乳糖。

发明内容

本发明的目的是以半乳糖作为底物，加入微生物来源的α-半乳糖苷酶，通过α-半乳糖苷酶的催化作用制备α-低聚半乳糖，并分离纯化不同α-低聚半乳糖产物。

附图说明

图1为酶合成反应产物的HPLC图谱

图2为合成的α-低聚半乳糖的质谱图

图3为合成的α-低聚半乳糖的¹H-NMR图谱

图4为合成的α-低聚半乳糖的¹³C-NMR图谱

具体实施方式

称取1.0g半乳糖置于螺口瓶中，再加入一定量蒸馏水后进行高压处理(121℃，20min)，使其完全溶解得到过饱和半乳糖溶液，自然冷却至反应温度40℃。然后加入适量的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH5.5)和蒸馏水调整半乳糖浓度至60％(w/v)。称取一定量的α-半乳糖苷酶(30U/g半乳糖)加入上述体系并置于40℃水浴中开始反应，然后每隔一定时间取样，沸水浴10min使酶灭活，得到各种α-低聚半乳糖产物。

α-低聚半乳糖产物的分离纯化方法：反应液加适量的去离子水稀释后，经0.45μm滤膜过滤，滤液过活性炭-硅藻土(1∶1，w/w)中压层析柱。层析柱用一系列线性浓度梯度的乙醇进行洗脱，得到4种低聚半乳糖产物，其中2种互为同分异构体的α-低聚半乳二糖(包括α-(1→6)Gal2和α-(1→3)Gal2)，2种为互为同分异构体的α-低聚半乳三糖(其中一种为α-(1→6)Gal3，另外一种可能为α-(1→3)Gal3))，合并不同反应产物、浓缩、冷冻干燥。反应产物进行¹H-NMR、¹³C-NMR和ESI-TOF-MS分析。