[发明专利]一种定量分析蛋白质间相互作用的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中蛋白质间相互作用的定量分析方法，特别是涉及一种将双荧光素酶(萤火虫荧光素酶Firefly Luciferase，Fluc和海肾荧光素酶RennilaLuciferase，Rluc)用于定量分析蛋白质间相互作用的方法及其应用。

背景技术

蛋白质间相互作用是各种生理活动的基础，与细胞的各种生命活动紧密相关。由于很多疾病的发生与细胞内过强或过弱等不正常的蛋白质间的相互作用密切相关，很多药物也通过调节蛋白质间相互作用的强弱实现治疗作用，因此，研究蛋白质间的相互作用，能更好地理解各种疾病的发病机制、并发现新的药物作用靶标。

鉴定蛋白质相互作用的方法多种多样。经典的免疫共沉淀(Co-IP)、Pull down技术只能对蛋白质相互作用进行半定量分析。酵母双杂交、荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、表面等离子体共振(SPR)、串联亲和纯化技术(TAP)、蛋白质片段互补分析(PCA)和双分子荧光互补技术(BIFC)等方法，可用于鉴定体内外蛋白质之间的相互作用。基于化学发光定量检测蛋白质相互作用的方法有：PCA、LUMIER和LuMPIS等，PCA只能对两种蛋白发生相互作用的总量进行确定，无法对发生相互作用的其中任何一种蛋白进行定量；LUMIER和LuMPIS仅能对发生相互作用的其中一种蛋白进行定量。

尽管上述各种方法的综合应用已经鉴定了成千上万种蛋白质的相互作用，但很多蛋白质间的精确定量信息仍然未知，例如相互作用的各种蛋白质的量、它们之间的相对分子数、以及发生相互作用蛋白与细胞内所有同种蛋白的比例等。精确定量分析蛋白质间的相互作用的方法的缺乏，仍然制约着对包括致病机制在内的很多生物学过程的理解。因此，发展简单、灵敏、高效、定量分析蛋白质间的相互作用的新方法仍然亟待研究探索。

荧光素酶(Luc)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称。双荧光素酶报告基因(DLR)检测系统是Promega公司开发的，应用两种不同底物同时定量检测两种荧光素酶活性的生物发光分析系统，可对同一样品中的两个报告基因-Fluc和Rluc的表达水平同时进行定量测定。样品与底物混合后，能在20秒内完成DLR定量检测，灵敏度在pg级，是灵敏度为ng级的Western Blot的约10³倍，因此该系统具有快速、灵敏、简便的优点。DLR通常用于研究启动子、增强子的活性和研究基因表达调控的机制。检测基因表达时通常将双报告基因(即带有实验报告基因的载体和带有不同的报告基因作为内对照的载体)共转染细胞，报告基因表达活性的改变反映启动子转录活性的改变，实验中作为内对照的第二个报告基因，能使实验报告基因的检测均一化，从而减少实验的变化因素，提高实验的准确性。

由于双荧光素酶检测系统(DLR assay system)能快速、简便、灵敏地对裂解细胞中两种荧光素酶的表达水平进行定量检测，因此用DLR assay取代蛋白质相互作用传统研究方法Pull down中的蛋白检测步骤，建立一种无需SDS-PAGE、无需Western Blot、无需杂交抗体，同时又能定量检测蛋白质之间相互作用的快速、灵敏、简便的新方法，在理论上存在可能性。

那么如何才能用DLR assay取代Pull down实验中的蛋白检测步骤？可通过将Fluc和Rluc分别与Pull down的目的蛋白X和预测蛋白Y分别融合表达，融合蛋白在细胞内或细胞外孵育后进行纯化，通过定量检测纯化得到的Fluc和Rluc活性则可确定蛋白X、Y之间发生相互作用的情况。如果预测蛋白Y与目的蛋白X之间存在相互作用，Y通过与X的结合而被检测到，用DLR assay可对与磁珠结合的Fluc-X和Rluc-Y融合蛋白的Fluc、Rluc活性进行高灵敏定量检测，相互作用越强，沉淀下来的Rluc相对于Fluc的比值就会越高。反之，如果预测蛋白Y与目的蛋白X之间不存在相互作用，沉淀下来只有Fluc-X融合蛋白，没有Rluc-Y融合蛋白，双荧光素酶系统就只能定量检测到Fluc活性，而不能检测到Rluc活性。

发明内容

本发明提供了一种简单、快速、灵敏的定量分析蛋白质间相互作用的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种定量分析蛋白质间相互作用的方法，是将Fluc和Rluc分别与要定量分析相互作用的目的蛋白X和预测蛋白Y融合表达，融合蛋白Fluc-X、Rluc-Y结合纯化后用DLR对相互作用蛋白的量进行精确定量，并对表达蛋白的总量进行精确定量，还可对相互作用蛋白之间的分子数量比例进行定量。