[发明专利]一种重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化领域，具体地说，涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)成熟肽的纯化生产方法。

背景技术

1965年，美国医生Urist(Urist MR.Bone：formation byautoinduction.Science，1965，150(698)：893-899)发现脱钙的骨间质有异位成骨作用，并将新发现的具有诱导新骨形成的蛋白质命名为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic protein，BMP)。随后，又发现了众多的BMP，除了BMP-1，它们都是TGF-beta超家族成员，无论在基因或者蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似。其中BMP-2的成骨作用研究的最多，产业化研究也最为广泛。

人BMP-2全长为396个氨基酸残基，具有成骨作用的是成熟肽，由114个氨基酸组成，在55位的天冬酰胺残基上有糖基化位点，但是糖基化与否并不影响其生物活性。此外BMP-2疏水性很强，几乎不溶于各种溶剂，其活性形式以二聚体形式存在，其中单体各形成3对二硫键，在两个单体之间形成一对链间二硫键。二硫键的正确配对与否直接影响其生物活性和稳定性。体内外试验证明BMP-2具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力(Riley，EH；Lane，JM；Urist，MR，et al.Bone morphogenetic protein-2：Biology and applications.ClinOrthop Relat Res.1996Mar；(324)：39-46)。但是天然的BMP-2在各种组织中的含量极低，需要采用基因重组的方法进行大量生产。

在BMP-2的产业化研究方面，主要是真核表达载体和大肠杆菌为代表的原核表达体系两种基因重组方案。真核表达载体国内还未实现产业化，1988年，wozney等(Wozney J.M.，Rosen V.，Celeste A.J.etal.Novel regulators of bone formation：molecular clones and activities.Science 16 December 1988；242(4885)：1528-1534.)获得了COS-1真核表达的BMP-2；1992年，Israel DI获得了CHO真核表达的BMP-2(Israel DI，Nove J，Kerns KM，Moutsatsos IK，Kaufman RJ.Expressionand characterization of bone morphogenetic protein-2 in Chinese hamsterovary cells.Growth Factors 1992；7：139-50)；美国Medtronic SofamorDanek公司研制的INFUSE骨移植剂和LT-CAGE腰椎融合器械在2002年7月获得FDA批准用于治疗椎间盘退行性疾病(McKay WF，Peckham SM，Badura JM.A comprehensive clinical review ofrecombinant human bone morphogenetic protein-2(INFUSE Bone Graft).Int Orthop.2007 Dec；31(6)：729-34)；Wyeth公司开发的InductOs(TM)(rhBMP-2/ACS)于2002年9月获得欧洲委员会(EC)的批准，用于成人急性胫骨骨折的治疗(Govender S，Csimma C，GenantHK，et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 fortreatment of open tibial fractures：a prospective，controlled，randomizedstudy of four hundred and fifty patients.J Bone Joint Surg Am.2006Jun；88(6)：1258-65)。INFUSE骨移植剂和InductOs的表达体系都为CHO细胞，表达量低，生产成本很高，并不适合中国发展现状。