[发明专利]用拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法

说明书

技术领域

一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法，属于免疫分析化学技术领域。

背景技术

随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库，使水体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins)，威胁人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)分布最广、危害最大，其结构如下：

其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、Y。即在上述的结构式中其中X和Y分别为Leu和Arg的即为MC-LR。MC-LR是最为常见且毒性又最大的一种微囊藻毒素，世界卫生组织(WHO)推荐的饮用水中的MC-LR的最大残留限量为1.0μg/L，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001，0.001mg/L)和地表水环境质量标准(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR，0.001mg/L)，因此急需建立针对MC-LR检测的一种快速、简单、灵敏、省力的检测方法。

常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等，这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单，专一性好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。

本发明的技术方案：一种基于拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下的检测微囊藻毒素(MC-LR)的方法，包括包被原和抗体的修饰，抗体和金纳米棒的偶联，包被原和金纳米棒的偶联，信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联，标准曲线的测定。步骤为：

(1)包被原的修饰：

将微囊藻毒素MC-LR的包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的藻毒素包被原；

(2)抗体的修饰：

将抗微囊藻毒素MC-LR的抗体与硫辛酸相偶联得到修饰的抗微囊藻毒素MC-LR的抗体；

(3)用步骤(1)得到的修饰的藻毒素包被原与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-包被原探针GNR-Ag；

(4)用步骤(2)得到的修饰的抗微囊藻毒素MC-LR的抗体与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-抗体探针GNR-Ab；

(5)信号分子4-氨基苯硫酚和GNR-Ab金纳米捧的侧面偶联；

(6)微囊藻毒素MC-LR含量检测：利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素MC-LR和步骤(3)得到的金纳米棒-包被原探针同时加入到一个离心管中，而后向离心管中加入步骤(4)得到的金纳米棒-抗体探针，混匀，通过微囊藻毒素MC-LR和金纳米棒-包被原探针与金纳米棒-抗体探针进行竞争偶联，通过微囊藻毒素MC-LR浓度的不同使形成的金纳米粒子形成不同的粒径分布，不同程度组装形成的纳米链对于拉曼信号的增强作用不同，通过拉曼仪器测定液体环境中的纳米链对于信号分子所产生的信号强度来间接测定微囊藻毒素的含量。

所述包被原的修饰：

①含硫辛酸1.625mg的0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液与含2mg的0.2mL的藻毒素包被原溶液混合；

②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h；

③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析三天，每天换三次透析液；

④将修饰后的藻毒素包被原放在4℃备用。

所述抗体的修饰：

①含硫辛酸1.625mg的0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液与含4mg的0.4mL的藻毒素抗体混合；

②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h；

③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析三天，每天换三次透析液；

④将修饰后的藻毒素抗体放在4℃备用。