[发明专利]一种R-藻蓝蛋白标记的荧光抗抗体的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin，RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法，属于免疫荧光检测领域。

技术背景

免疫荧光检测法是一种历史悠久的标记分析法，兼具有抗原、抗体反应的特异性及荧光检测的灵敏性，广泛应用于疾病检测和生物学研究中。免疫荧光检测法的特异性和敏感性依赖于荧光染料、抗体及荧光探针的属性和质量。在实际应用时，由于血清和其他生物样品发射波长为400～600nm的本底荧光，与常用的FITC等传统荧光染料的荧光发射光谱重叠，严重降低荧光检测的灵敏度，造成一段时期内免疫荧光检测法发展缓慢。

多管藻是生长在我国沿海地区潮间带的特有海洋红藻，含有大量的R-藻蓝蛋白，是提取R-藻蓝蛋白的比较理想的试材。R-藻蓝蛋白的稳定态为(αβ)₃，分子量约为104.9kDa，是唯一同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白。多管藻RPC有2个吸收峰，最大吸收峰分别位于540、620nm。540nm激发光激发时室温最大荧光发射峰位于632nm。与传统的荧光染料相比，RPC具有水溶性、无毒性、摩尔消光系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、发射红色荧光、背景光干扰小、不易淬灭等特点，因而是一类优秀的荧光染料。

RPC用于免疫荧光检测需要将其与抗体或抗抗体交联制备荧光探针，RPC与抗体交联得率低，造成RPC荧光标记物生产成本居高不下，成为限制其应用的瓶颈因素。本发明选择温和型的异型双功能化学交联剂SPDP将RPC与抗抗体液相化学交联制备通用型荧光抗抗体，通过优化交联剂浓度既保证了交联效率又不影响荧光亮度和抗体活性，成功制备出RPC标记的荧光二抗，可方便地用于传染病病原的间接免疫荧光检测，省去了直接免疫荧光检测时需要针对每种病原的抗体制备荧光标记抗体的麻烦，同时采用标记的抗抗体作为信号放大系统，还能提高免疫荧光检测的灵敏度。目前国内外尚没有RPC应用到动物疫病检测中的报道。

发明内容

本发明涉及一种R-藻蓝蛋白(RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法。

本发明采用的R-藻蓝蛋白(RPC)是纯化自多管藻的典型的二峰型藻蓝蛋白，是唯一同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白，具有无毒性、水溶性大、荧光明亮且不易淬灭等特点。RPC的组成和晶体结构特点决定了低稳定性，因此在蛋白质交联是控制交联剂的浓度是关键，浓度过高会造成RPC的变性和荧光丧失，浓度过低则交联效率降低。

本发明的解决方案如下：

RPC的制备：RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯化，纯化过程为：取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5.8)，4℃下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60％(w/v)，4℃放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的R-藻蓝蛋白，用20mM醋酸缓冲液(pH4.8)(含50mMNaCl)一步洗脱就可得到大量纯的R-藻蓝蛋白，纯化的多管藻RPC纯度达电泳纯，纯度指数A₆₂₀/A₂₈₀＞4.5，结构式为(αβ)₃，分子量约为110kDa，最大吸收峰分别位于540、620nm，室温荧光发射峰位于640nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4℃避光保存，使用前用50mM pH7.5PBS充分透析除盐，调整浓度为10mg/mL。

RPC标记荧光抗抗体的制备：抗抗体为抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体，购自Sigma公司，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。RPC与抗抗体的交联采用蛋白质交联法。利用异型双功能交联剂SPDP分别在RPC、抗抗体上衍生吡啶二硫基团，然后用DTT还原抗抗体的衍生物引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的RPC与携带巯基的抗抗体按一定摩尔比交联制备荧光抗抗体。以DMSO准确配制SPDP母液，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为20-30∶1、50-100∶1，混匀、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按50-100∶1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混匀，室温静置反应1h，超滤离心除去多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1∶2-3混匀，铝箔封好后于20-25℃振荡反应20h。加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。