[发明专利]一种R-藻蓝蛋白标记的荧光抗抗体的制备方法

权利要求书

1.一种R-藻蓝蛋白(RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法，包括：阴离子交换层析法制备多管藻RPC，分别用摩尔比20-30∶1、50-100∶1的交联剂SPDP将RPC、抗抗体衍生，抗抗体的SPDP衍生物经摩尔比50-100∶1的DTT还原获得带-HS的抗抗体，带-HS的抗抗体与RPC的衍生物以摩尔比1∶2-3液相交联，经HPLC纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的间接免疫荧光检测。

2.根据权利要求1的方法，其中RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯化，纯化步骤为：取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5.8)，4℃下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60％(w/v)，4℃放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品和杂质，用20mM醋酸缓冲液(pH4.8)(含50mM NaCl)一步洗脱就可得到大量纯的RPC，纯化的多管藻RPC纯度达电泳纯，纯度指数A₆₂₀/A₂₈₀＞4.5，结构式为(αβ)₃，分子量约为110kDa，最大吸收峰分别位于540、620nm，室温荧光发射峰位于640nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4℃避光保存，使用前用50mM pH7.5PBS充分透析除盐，调整浓度为5mg/mL。

3.根据权利要求1的方法，其中抗抗体为抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体，购自Sigma公司，电泳检测纯度达电泳纯，对流免疫电泳法检测抗抗体具有良好的生物学活性，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。

4.根据权利要求1的方法，其中荧光抗抗体的制备采用蛋白质交联技术在液相体系中化学交联制备，制备方法为：以DMSO准确配制SPDP母液，分别用双功能化学交联剂SPDP衍生RPC、抗抗体，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为20-30∶1、30-60∶1，混匀、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按30-60∶1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混匀，室温静置反应1h，超滤离心除去多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1∶2-3混匀，铝箔封好后于20-25℃振荡反应20h，加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。

5.根据权利要求1的方法，其中荧光抗抗体经HPLC纯化，纯化在液相色谱工作站上进行，液相柱型号TSK G3000sw(规格7.5mm×60cm)，流动相为50mM pH 7.5PBS，流速0.5ml/min，检测波长190-800nm，收集洗脱19.57min出现的产物峰，置4℃避光保存。