[发明专利]免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体及其构建与应用无效
| 申请号： | 201010282600.3 | 申请日： | 2010-09-16 |
| 公开（公告）号： | CN101979595A | 公开（公告）日： | 2011-02-23 |
| 发明（设计）人： | 张彩;兰培祥;田志刚;张建 | 申请（专利权）人： | 山东大学 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/113;C12N15/117;C12N15/66;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/20 |
| 代理公司： | 济南圣达专利商标事务所有限公司 37221 | 代理人： | 杨琪 |
| 地址： | 250014 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 免疫 刺激 rna hbv 基因 沉默 表达 载体 及其 构建 应用 | ||
1.一种免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体，其特征在于：是由转录shRNA的DNA序列、转录ssRNA的DNA序列与pTZU6+1载体组成的重组载体，其序列如seq.1所示。
2.权利要求1所述的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)针对HBV x基因的序列，人工设计合成shRNA相对应的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点Sal I和Xbal I，退火形成双链结构，得表1所示的序列；
(2)将pTZU6+1载体进行SalI和XbalI的双酶切，并回收载体骨架；
(3)将步骤(1)制得的序列与步骤(2)制得的pTZU6+1载体连接，构建pTZU-shRNA重组载体；
(4)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000将构建的pTZU-shRNA转染到HBV感染的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，并检测HBV x基因的表达水平，筛选具有转录较好沉默能力的shRNA序列的DNA序列；然后将筛选得到的pTZU-shRNA重组载体进行EcoR I和Hind III双酶切，得到U6+shRNA的表达框，其序列如seq.2所示；
(5)根据能够激活免疫系统的RNA病毒序列，设计编码具有潜在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的两端添加双酶切位点序列EcoRI和BamH I，得表2所示的序列；
(6)将pSIREN载体进行EcoR I和BamH I双酶切，并回收载体骨架；
(7)将步骤(5)制得的序列与步骤(6)制得的pSIREN载体连接，构建pSIREN-ssRNA重组载体；
(8)利用阳离子脂质体Lipofectamine2000将构建的pSIREN-ssRNA转染到小鼠巨噬细胞系RAW264.7、新鲜分离的小鼠肝淋巴细胞、人肝癌细胞系HepG2和HBV感染细胞系HepG2.2.15，并检测细胞因子IFN的RNA水平和蛋白水平，筛选能够激活免疫系统的表达载体，得到的具有刺激作用的序列，然后将筛选得到的pSIREN-ssRNA重组载体进行EcoRI单酶切，得线性片段；
(9)将步骤(3)制得的U6+shRNA表达框和步骤(6)制得的线性片段平端化，连接，即得到表达shRNA和ssRNA的双表达载体，其序列如seq.1所示。
3.权利要求1所述的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的双表达载体在制备抗HBV的药物中的应用。
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