[发明专利]一种BAC DNA指纹分析的标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于BAC-DNA指纹分析的标记方法，具体地说是采用普通Taq DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP(Gold 525dUTP)，可以对酶切后的BAC DNA(细菌人工染色体DNA)片段进行标记，然后用于ABI系列的测序仪上进行DNA片段分析的方法。 

背景技术

DNA是地球上各种生物的遗传物质基础。限制性核酸内切酶可以切割DNA分子，而且每一限制性核酸内切酶都有固定的切点序列。由于不同生物群体的DNA序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA片段的长度分布也是千变万化的；同时DNA分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该酶切位点丢失或增加，或者酶切片段的长度增加或减少。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，RFLP常用于生物群体的遗传分析。近年来，基于RFLP的原理，发展了一系列的DNA片段分析技术，如聚合酶链反应/限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)，扩增片段长度多态性(Amplification Fragment Length Polymorphism，AFLP)，限制性酶切指纹图谱(FingerprintMap)等，这些新技术使DNA片段多态性分析更为快速和完善，同时应用也越来越广泛。 

限制性酶切指纹图(Fingerprint Map)是指限制性酶切位点在DNA分子上的分布图，DNA分子上的酶切位点可以作为一种DNA标记定位的特征区域。基于限制性酶切指纹重叠群图谱(Fingerprint Contig Map)是将一套部分重叠的大片段基因组DNA分子(Yeast artificial chromosome YAC，Bacterial artificial chromosomeBAC克隆等的插入片段)依其在染色体上的位置顺序排列，不间断地覆盖着染色体上一段完整的区域。重叠群图谱是目前最常见的物理图谱，因为重叠群就是克隆之间的相互重叠关系，这是物理图的基本框架，然后借助染色体特异性的分子标记可将重叠群定位在染色体上。 

目前构建重叠群物理图谱主要方法是用毛细管电泳法来分析BAC DNA(Bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体DNA)片段的大小，一般首先 用3-4个6碱基识别位点的限制性内切酶酶切DNA以产生不同的3′粘性末端，然后用荧光染料标记；另外一个4碱基识别位点酶消化DNA后产生5′平末端，该酶主要用于增加酶切片断的数量。然后酶切产物连同分子内标在DNA分析仪上进行毛细管电泳，电泳过程中电脑自动捕获荧光信号得到DNA片段大小的信息，经编辑后用FPC软件进行重叠群的组装(Luo M.C.，Thomas C.，You F.M.，HsiaoJ.，Ouyang S.，Buell R.，Malandro M.，McGuire P.E.，Anderson O.D.，and Dvorak J.，2003，High-throughput fingerprinting of bacterial artificial chromosomes using theSNaPshot labeling kit and sizing of restriction fragments by capillary electrophoresis，Genomics，82(3)：378-389)。该方法具有序列分析胶的高分辨率，但又免去了序列分析胶法的放射自显影步骤，省去了目力识带及随之带来的误差，因而具有高通量、自动化的特点。