[发明专利]一种BAC DNA指纹分析的标记方法

权利要求书

1.一种BAC DNA指纹分析的标记方法，其特征在于：

1)将BAC DNA样品采用限制性内切酶进行酶切，得酶切的BAC DNA片段；

2)采用一种荧光标记的dUTP和Taq DNA聚合酶对酶切后的BAC DNA片段进行标记，然后即可用于ABI测序仪上进行DNA片段分析。

2.按照权利要求1所述的标记方法，其特征在于：步骤1)将BAC DNA样品采用2-6种不同种类的限制性内切酶进行酶切，得酶切的BAC DNA片段。

3.按照权利要求2所述的标记方法，其特征在于：2-6种不同种类的限制性内切酶包括：1种4碱基识别位点的内切酶和1-5种6碱基识别位点的内切酶。

4.按照权利要求1所述的标记方法，其特征在于：步骤2)中的dUTP为Gold525dUTP。

5.按照权利要求1所述的标记方法，其特征在于：

1)BAC DNA的酶切和标记的具体过程为：

A.：在10μL浓度为0.5-1.5μg/μL BAC DNA样品中加入3μL酶切混合物(10×限制性内切酶buffer 1.3μl；100mg/mlBSA0.13μl；相应的2-6种不同种类的限制性内切酶每种1U；加超纯水补足3μl)，混合均匀，37℃水浴放置酶切1.5-2.5h，置于冰上；

B.每样品加入7μL标记混合物(10×PCR buffer 2μl；25mM MgCl₂1.6μl；含有12.5μM Gold 525dUTP的dNTP混合物0.05μl；5U/μl TaqDNA聚合酶0.16μl；超纯水3.29μl)，65℃水浴孵育45min-1.5h，置于冰上；

C.每样品加2μl的醋酸钠(5.2M，pH5.2)和70μl无水乙醇，混合均匀，置-80℃或-20℃放置30min；

D.3250-4000rpm 4℃离心30min沉淀DNA；

E.倒去上清，加0.2ml 70％冷乙醇4℃3250rpm离心二次，每次15min；

F.倒去上清后，DNA沉淀在超净台中干燥15-30min；

2)指纹分析检测：

在每个样品中加入9.85μL去离子甲酰胺和0.15μLSize Standard，在金属浴上95℃变性3-5min，然后按照操作要求在ABI系列测序仪上进行片段分析。

6.按照权利要求5所述的标记方法，其特征在于：该方法中所使用的dNTP混合物中的四种脱氧核糖核酸的摩尔比为dATP∶dGTP∶dCTP∶Gold 525dUTP＝4∶4∶4∶1。