[发明专利]一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉抑制酸乳发酵及储藏的技术领域，具体涉及从酪蛋白酶解液分离得到的具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的生物活性单肽及其应用。

背景技术

酸乳是指在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的作用下，使用添加 ( 或不添加 )乳粉( 全脂或脱脂)的乳进行乳酸发酵而得到的凝固乳制品，最终产品中必须含有大量的活菌。乳酸菌的发酵作用可以使乳白蛋白变成微细的凝乳粒，易于消化吸收，发酵过程中乳酸菌可以产生机体营养所必需的维生素、烟酸和叶。酸乳除了保留了牛奶的全部营养外,其与鲜奶最显著的差异就是在于它还含有大量的乳酸及易于人体肠道健康的活性乳酸菌。

我国酸乳生产中所用的乳酸菌大多为国外购进的直投式发酵剂(Direct-to vat caulture，简称DVS)，继代式酸乳菌种的应用量相当小。与液体菌种相比，直投式发酵剂的潜伏期要长得多。其发酵时间通常比使用传统的翻代液体发酵剂要延长2～3小时左右，对于大型乳品厂，这是一个不容忽视的影响因素。因此，如何缩短直投式菌种的发酵时间，提高生产效率，以及如何采取有效手段在减少发酵剂使用量，同时保证产品品质，来降低成本也是重要的研究方向。

在酸乳发酵过程中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌具有生长互补的作用或称为共生(Mutualism)，球菌的生长同时会促进杆菌的生长，而杆菌生长形成的代谢产物又保证球菌的生长。乳杆菌对酸乳的贡献是分解蛋白质、产酸，链球菌对酸乳的良好风味和感官品质具有重要作用。酸乳在货架期必须保持微生物活性和良好的质构和风味。即使冷藏在0～5℃条件下，乳酸菌的新陈代谢导致的后酸化现象依然存在，这造成过乳清析出、酸味过重甚至产生涩味。以上现象严重影响酸乳的品质导致其保质期被大大缩短。

因此，通过在酸乳中添加具有含有益生功能因子的酪蛋白生物活性肽，有效地促进酸乳发酵缩短发酵时间并且抑制酸乳再储藏期间产生后酸化延长酸乳保质期，对酸乳行业具有重大的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种有牛乳来源的、高安全性的、具有可产业化的酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种酪蛋白活性单肽的制备方法与应用，包括如下步骤：

（1）在50℃～55℃，pH 6.0-7.5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；

（2）当水解度达到9％～10％时，90～95℃加热15～20min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；

（3）将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。

上述的制备方法，步骤（3）中将灭酶活的酶解液在4℃下以6000 g离心20分钟，将上清液经超滤（取分子量小于3000道尔顿的组分）后，采用大孔树脂NKA-II, 收集10-20%（w/w）乙醇洗脱液，接着采用Sephadex（葡聚糖凝胶） G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经Sephadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C₁₈高效液相色谱分离纯化，分离条件为：5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集。

本发明还提供了由上述制备方法制得的具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的酪蛋白活性单肽。

上述酪蛋白活性单肽，通过液相色谱-电喷雾串联质谱测定其分子量为801.4道尔顿，该活性单肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。

所述的酪蛋白活性单肽可应用于酸乳发酵中，促进酸奶发酵，抑制酸奶后酸化。

    本发明采用了以上技术方案，具有如下优点和效果：

1、本发明通过对酪蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了氨基酸序列为NPSKENL的肽，该活性肽具有明显缩短酸乳发酵时间和抑制酸乳后酸化作用。

2、本发明分离纯化所得的生物活性肽是从酪蛋白中分离得到的乳源性肽，可以安全的添加的到酸乳中。

附图说明  

图1为Sephadex G-25对酪蛋白酶解液的初步分离图；

图2为RP-HPLC对生物活性肽的分离纯化图；

图3为实施方式中添加50ppm（w/w）生物活性单肽对酸乳发酵周期和空白对照对应酸乳发酵周期的影响曲线；

图4为实施方式中添加50ppm（w/w）生物活性单肽对酸乳储存期产酸的影响曲线和空白对照对应的影响曲线。