[发明专利]凤眼莲的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及凤眼莲的遗传转化方法。

背景技术

凤眼莲(Eichhornia crassipes)属于种子植物门雨久花科凤眼莲属，俗称水浮莲、水葫芦。1901年，凤眼莲被作为观赏植物引入中国，上个世纪五六十年代被作为猪饲料推广，从此之后凤眼莲在中国一发不可收拾。由于凤眼莲十分喜肥，尤其是氮磷肥，因此目前广泛存在于我国滇池、巢湖、太湖等很多水体富营养化的水域中。凤眼莲具有很强的富集N/P等营养元素、多种重金属、吸收降解酚和氰等净化作用，同时凤眼莲提取物本身具有抑制藻类生长的效果。另外，凤眼莲还具有作为猪等家畜禽饲料、肥料、造纸和酿酒原料、产沼气等诸多应用潜力。然而，凤眼莲的繁殖能力极其旺盛，一旦处于适合的环境，它便无序地繁殖、成为当地的入侵杂草，抑制其他物种、破坏生态多样性，造成该区生态恶化。而且，因其繁殖力过于强盛和难以及时打捞，导致其在水中腐烂、被吸收的N、P等重新释放于水体中，达不到去除污染源的净化作用。特别是凤眼莲爆发成灾时可覆盖整个湖面和河流，堵塞河道，降低水中溶解氧浓度和水体透光度，致使水生动植物缺氧、缺光而死亡。因此，目前的凤眼莲不但没有成为消除富营养化的净化植物，反而成了生态入侵的恶性水生杂草，以及导致各地投入大量人、物和财力进行治理的对象。

凤眼莲在水体环境修复与治理工程中，至今未获得成功的关键原因在于：一是生长繁殖过盛而难以控制所导致的二次污染成灾问题；二是可回收利用的价值低、产业化难的问题。因此，通过植物基因工程手段，对凤眼莲加以遗传工程改良，介导其高附加值，提高其回收利用的经济价值，将有助于促进凤眼莲水体净化的周转频率，推进其回收应用的产业化进程。由于凤眼莲是具有特殊习性的水生植物，其外植体极易褐化，愈伤组织诱导及分化尚无法实现，人工组培凤眼莲完成生活史、并进一步开展基因工程改良也十分困难。因此，凤眼莲的基因转化一直未见获得成功的报道，在国内外尚处于空白。

目前，植物基因转化方法主要分为两种：1)介导载体系统转化(农杆菌介导法、脂质体介导法等)；2)直接遗传转化(基因枪法、PEG法、电击法、显微注射法、花粉管通道法和超声波法等)(Hamilton C M.et al.，1996；Liu Y G.et al.，1999；Ohta Y.1986；任永霞等，2005)。其中，花粉管通道法遗传转化不需要组织培养过程，操作相对简单、容易。

花粉管通道法的基本原理是：在授粉后向子房注射目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中从柱头到胚囊之间形成的花粉管通道，使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备完整细胞壁的合子或早期胚胎细胞，使外源DNA被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为转入外源基因的新个体，实现基因转化的目的。

然而，该方法实际包括的是一个以狭义授粉/受精为中心的过程，是一个非常复杂的生理现象，即包括花粉形成、传粉、花粉萌发、花粉管伸长以及继花粉管伸长之后的受精等过程，甚至还包括拒绝受精现象。因此，对于不同植物，需要选择的转化时期、转化方法也存在较大的差别。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease vimse，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为动物卫生法典中的A类疫病之首。传统的灭活疫苗在该病的防控中起了重要作用。近年来随着生物技术的发展，因其具备诸多可食疫苗的优点而成为国内外研究的热点。国内外在口蹄疫转基因植物疫苗的研究中已取得了可喜的成果，易感动物食用该转基因植物后能够产生免疫力，达到预防口蹄疫的目的。

目前为止，用作转基因植物疫苗的免疫原基因主要是FMDV的编码结构蛋白VP1基因和编码病毒衣壳蛋白的P1基因、非结构蛋白2A、3C所共同组成的免疫原基因。1999年，Wigdorovitz A等将FMDV结构蛋白基因在苜蓿中有效表达，表达产物口服和注射都产生了免疫反应和保护。2001年，Carrillo C等将FMDV VP1基因在马铃薯中表达。

水生植物凤眼莲，繁殖力强大，生物量高，具备成为优良生物反应器的潜质。然而，由于其特殊的生理特点，很难进行转基因研究，深度开发利用受到限制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种雨久花科植物的遗传转化方法。