[发明专利]凤眼莲的遗传转化方法

权利要求书

1.一种雨久花科植物的遗传转化方法，包括如下步骤：在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后和花粉管通道闭合之前，将含有外源基因的重组质粒的溶液或含有外源基因的重组菌的溶液滴加到授粉后的柱头上，使所述外源基因通过花粉管通道导入受精卵细胞，随着受精卵细胞的生长发育，得到转入所述外源基因的种子；所述滴加至少为一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后至花粉管通道闭合之前为自授粉时计起第2小时到第6小时，优选为第3h到第5h，具体为第3小时或第4小时或第5小时，所述授粉时为第0小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述滴加为二次；第二次滴加的时机为自第一次滴加时计起第0.5小时后，所述第一次滴加时计为第0时。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：每次滴加时，所述含有外源基因的重组质粒的溶液的滴加量为3ul，所述含有外源基因的重组菌的溶液的滴加量为5ul。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述授粉是人工授粉；所述人工授粉的时间为一束花序上有50％以上的花朵展开八成以上；

所述含有外源基因的重组质粒的溶液中重组质粒的浓度为100ng/μl-200ng/μl，具体为100ng/μl；所述含有外源基因的重组菌的溶液的OD₆₀₀值为1.0-1.2，具体为1.0。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述人工授粉的时间为上午9点-11点；

所述含有外源基因的重组质粒的溶液由0.1×SSC缓冲液和所述含有外源基因的重组质粒组成；

所述含有外源基因的重组菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、赤霉素、6-糠基氨基嘌呤、所述含有外源基因的重组菌和水组成，蔗糖在溶液中的浓度为50g/L，Silvet L-77在溶液中的浓度为200μL/L，赤霉素在溶液中的浓度为5μg/L，6-糠基氨基嘌呤在溶液中的浓度为0.1mg/L；所述含有外源基因的重组菌的溶液的pH值为5.8。

7.一种培育转基因雨久花科植物的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求1-6中任一所述方法得到转入外源基因的雨久花科植物种子；

2)搓伤种皮：将石英砂与所述转入外源基因的雨久花科植物种子混合，摩擦，搓伤种皮，得到搓伤种皮的种子；

3)将所述搓伤种皮的种子进行消毒处理，得到消毒后的种子；

4)将所述消毒后的种子进行培养，得到植物幼苗；

5)对5叶龄的植物幼苗进行抗性筛选，得到转入外源基因的雨久花科植物幼苗。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述石英砂与所述转入外源基因的雨久花科植物种子的质量比为10～15∶1，具体为10∶1，所述摩擦的时间为5分钟～8分钟，具体为8分钟；

所述步骤3)中消毒处理的方法包括如下步骤：将所述搓伤种皮的种子用无菌水清洗3次，无水乙醇浸泡1min，无菌水洗涤3次，加入10％(体积百分含量)的次氯酸钠水溶液浸泡10min，无菌水洗涤6次；

所述步骤4)中，所述培养的方法包括如下步骤：将所述消毒后的种子接种于MS培养基，在光照周期为16h光照/8h黑暗、光强为100μmol/m²·s、湿度为50％、温度为25℃的条件下培养；

所述步骤5)中，所述抗性筛选的方法包括如下步骤：用浓度为0.15％-0.25％(体积百分比)或0.2％(体积百分比)的草胺膦水溶液喷洒所述5叶龄的植物幼苗，自植物幼苗开始出现5叶时计起，第1周时喷洒第一次，第2周时喷洒第二次，第5周时检测幼苗是否存活，存活的幼苗即为所述转入外源基因的雨久花科植物抗性幼苗，植物幼苗开始出现5叶时计为第1周。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述含有外源基因的重组质粒是将所述外源基因插入载体pGII 0229的多克隆位点间得到的；

所述含有外源基因的重组菌是将重组表达质粒导入宿主菌得到的；所述重组表达质粒是将所述外源基因插入载体pGII 0229的多克隆位点间得到的。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述雨久花科植物为雨久花科凤眼莲属植物；所述雨久花科凤眼莲属植物为凤眼莲(Eichhornia crassipes)；

所述外源基因为VP1基因或GFP基因，所述VP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述宿主菌为农杆菌EHA105。