[发明专利]通过检测DNA浓度测定基质中食用菌菌丝生物量的方法

说明书

技术领域

本发明属测定食用菌菌丝生物量的方法领域，特别是涉及一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法。

背景技术

生物量是所有微生物生长状况的一项基本参数，生物量的测定是确定微生物培养过程的生长动力学和深入研究微生物代谢调控的基础。由于多数微生物与其生长基质的混合特性，很难直接测定其生物量，尤其在人工栽培的食用菌中菌丝深入培养基质内部，无法进行分离测定。

现有的微生物生物量测定方法有四大类：(1)直接从培养基中分离计数，如浊度法、直接计数法等；(2)通过检测代谢活动推断生物量，如氧气和二氧化碳的代谢、胞外漆酶法等；(3)测出生物体中某些特殊物质的含量推知其生物量，如几丁质分析法、麦角固醇法、嘌呤分析法、氮和蛋白质等；(4)利用与菌体生长有关的某些现象估测生物量。这些测定方法都有各自的局限性，如(1)要求纯培养状态，其余的方法是对一定系统中的微生物活动或特殊成分进行的估测，不能排除系统中其它干扰基质对结果的影响，因而不能准确定量也无法得知估测的误差范围。本方法目的明确，在构建待测种类真菌的DNA量和提取用菌丝量的标准曲线和相应基质对提取过程中DNA影响的基础上，采用直接测定含基质样品的DNA量，从而快速简便地得到单位质量待测样品中的食用菌菌丝生物量参数。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法，该方法简单，耗时少，能够快速，准确的检测培养基质中食用菌菌丝的生物量。

本发明的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法，包括：

(1)培养标准菌丝

取待测食用菌斜面培养物，活化后打碎，接入新鲜的标准液体培养基中，摇床培养至菌丝稳定期；

(2)菌丝处理

过滤菌丝，无菌水冲洗，冷冻至固态，充分干燥；

(3)构建标准曲线

将步骤(2)处理后的菌丝迅速研磨，梯度称取后置于容器中，用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量，构建提取DNA量和提取用菌丝量的关联标准曲线；

(4)相应基质DNA水平确定

取相应基质，用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量，确定基质DNA本底水平；

(5)培养菌丝与基质混合，确定相应基质对DNA提取的影响

称取步骤(2)处理后的菌丝与上述基质混合，用CTAB法提取DNA，NANODROP1000紫外分光光度计确定DNA量，与(3)和(4)的结果比较，确定该种基质对DNA提取的影响；

(6)待测样品中食用菌菌丝生物量的确定

取样品(该食用菌在基质中的培养物)冷冻干燥，研磨，定量秤取于容器中，用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量，对照标准曲线、基质本底和基质影响率，确定培养基质中的食用菌菌丝的生物量。

所述步骤(1)中的菌丝为香菇135菌丝。

所述步骤(1)中，待测食用菌标准菌丝的获得，取人工栽培的食用菌斜面菌种，活化后转接在新鲜的标准液体培养基中(根据情况选用商业化生产的PDB培养基，高氏培养基，查氏培养基等成分稳定，重复性好的标准液体培养基)，摇床培养至菌丝稳定期。

所述步骤(1)中的标准液体培养基为PDB培养基。

所述步骤(2)中的处理后的菌丝含水量接近零，且DNA在冷冻的条件下不易降解。

所述步骤(2)使用冷冻干燥机充分干燥。

所述步骤(3)中用CTAB法提取DNA，每处理5个重复。

所述步骤(3)中构建标准曲线是样品测定的基准，在CTAB法提取DNA和NANODROP1000紫外分光光度计确定DNA量的步骤中要设置重复和不同批次培养的菌丝间的对照，用以确定整个检测体系的误差范围。

所述步骤(4)中，人工栽培的食用菌都可以以不同的农作物废弃物按不同的配方进行人工培养，这些培养基质主要成分为主料(木屑、稻草、棉籽壳、甘蔗渣、玉米芯、麦秸等)和辅料(麸皮、米糠、豆饼等)，有时还根据需要增加糖和无机盐等添加成分，不同的原料和配方可能导致培养基质的DNA本底差异，这里需要在步骤(4)中确定与待测样品相同配方的培养基质的DNA水平，消除实际测量中由基质本底带来的影响。

所述步骤(4)中的相应基质取木屑先浸泡12-24h，再与麸皮混合，调整含水量至50％-60％，灭菌，然后冷冻至固态，再充分干燥。