[发明专利]安莎霉素发酵产量提高方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种安莎霉素发酵产量提高方法。

背景技术

安莎霉素(Ansamitocin)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的美登素衍生物，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成份安莎霉素AP-3(AP-3)，其侧链为异丁酰基，在低浓度下可抑制非白血性白血病细胞系及人类固体肿瘤。由于肠胃副效应及神经毒性，其研究还停留在临床二阶段。然而，由于Ansamitocin可在临床一期中作为抗体毒素结合物及免疫结合物，有重要的应用潜力。

安莎霉素的生物合成途径共包括48个基因(分散在两个基因簇)，其中asm2，8，18，29，31，34，39和asm40为调节基因；asm22-24和asm43-47负责安莎霉素起始单位的合成，asm13-17负责延伸单位methoxymalonyl-ACP的合成。研究表明，敲除或过表达asm2均能提高安莎霉素活性成份AP-3的产量，另外，过表达asm39也能有效地提高AP-3产量。敲除结构基因asm14，15，19和asm24等检测不到产物AP-3。在安莎霉素发酵方面，Bandi等报道了利用响应面法(RSM)优化野生型和asm2突变株的发酵培养基，最大AP-3产率分别为5mg/(L.d)和8.7mg/(L.d)。

目前，已报道的野生型珍贵橙色束丝放线菌产Ansamitocin主要为液体发酵，产量在12mg/L-60mg/L之间。

金属离子对微生物的生长发酵具有巨大的影响，参与生物体内许多酶活力的调节，例如镁离子是糖代谢过程中许多关键酶的辅因子。

经过对现有技术的检索发现，目前考虑提高AP-3的产量的方法主要集中在氮源和碳源，例如通过PB设计、响应面法及中心组合法优化的氮源有蛋白胨和酵母粉，碳源有蔗糖和糊精。氮源是用来构成菌体蛋白质、核酸等含氮物质，以及抗生素等含氮代谢产物。但是该技术成本高，培养基组分复杂，成分不确定，重复性差，且给研究机理带来了困难，对后续分离提取带来了很大的困难。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种安莎霉素发酵产量提高方法，通过在培养基中添加镁离子使安莎霉素的发酵产量获得显著提高。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

第一步、首先配置种子培养基，采用甘油融化接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，经二次培养得到二级种子；

所述的种子培养基的组分及重量百分比为：酵母提取物0.4％、麦芽糖1％、葡萄糖0.4％，加入98.2％蒸馏水并搅拌后调节pH值为7.45。

所述的甘油融化接种是指按0.5％-1.0％接种量，采用-70℃保存的甘油管经融化后融化接种于种子培养基。

所述的培养操作是指：在25-32℃环境下培养24-60h。

所述的二次培养是指：取一级种子按1.0-3.0％的接种量接种于种子培养基并进行培养操作。

第二步、配置发酵培养基，并将二级种子进行摇瓶培养；

所述的配置发酵培养基是指：配取组分及质量百分比分别为：酵母提取物1％、玉米粉滤液2％、葡萄糖0.5％、甘油4％、磷酸氢二钾0.05％、七水和硫酸亚铁0.0002％以及碳酸钙0.5％，加入91.498％蒸馏水并搅拌后调节pH值为7.45。

所述的摇瓶培养是指：将二级种子按1.0-3.0％接种量接种于含有发酵培养基的发酵摇瓶中。

第三步、将浓度为1M的硫酸镁水溶液添加至发酵摇瓶中进行发酵处理，然后将发酵摇瓶经摇床培养后实现发酵生产。

所述的发酵处理是指：发酵后的发酵摇瓶中镁离子浓度为0.1-20mM。

所述的摇床培养是指：将发酵摇瓶转入摇床并在25-32℃，150-300rpm条件下培养5-12天。

本发明与现有技术相比，发酵水平高，已明显超过原工艺的水平；操作简单且成本低，便于大规模生产。

附图说明

图1为实施例中以玉米粉滤液为碳源的效果示意图。

图2为实施例中以荞麦粉滤液为碳源的效果示意图。

图3为实施例中以玉米粉滤液为碳源的效果比较图。

图4为实施例中以荞麦粉滤液为碳源的效果比较图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1