[发明专利]利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及甘蓝型油菜育种领域，具体涉及一种利用小孢子培养和无性克隆技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法。

背景技术

甘蓝型油菜游离小孢子的分离技术简单，通过游离小孢子培养技术获得胚状体和再生苗的效率高，而且小孢子培养是研究花粉细胞分化条件、胚胎发生和形态建成机理的一种较为理想的方法，因此该技术一直受到各国油菜育种家的普遍青睐。多年来，许多学者对小孢子培养的培养基成份、蕾的大小、小孢子培养过程中温度的变化、提高再生苗频率等诸方面进行了广泛的研究，使得小孢子培养技术逐步成熟并得到了广泛的应用。

在常规杂交育种中，获得稳定遗传的后代或株系一般要经过5～8代性状选择。如果对F1代植株进行小孢子培养，再生植株为单培体，经染色体加倍后产生纯合二倍体单株(double haploid，简称DH)，这种二倍体单株各种遗传性状已纯合，不会发生分离，因此可以快速使性状纯合；在小孢子培养形成的DH系后代中，没有显性基因掩盖隐性基因表现的干扰，有利于对隐性基因的筛选；DH系后代的性状理论上是按照配子体基因型(花粉基因型)分离的，即以2ⁿ分离，而F₂代的性状理论上是按照胞质体基因型分离的，即以4ⁿ分离，为了得到目标性状单株，前者群体远远小于后者，因此甘蓝型油菜小孢子培养技术在许多油菜育种计划中得到应用。

20118A是上海市农业科学院孙超才研究员于1997年选育的一种新的隐性细胞核雄性不育，其不育株花药空瘪，无花粉，套袋自交不结实，且不育性稳定，不受环境条件的影响。通过普通遗传学研究证明20118A为隐性上位互作遗传模式，即其不育性受两对重叠隐性不育基因(a和b)与一对隐性上位抑制基因(rf)互作控制，隐性上位基因纯合时对隐性不育基因起作用。不育系可通过兄妹交保持，不育株的基因型有纯合型aabbRfRf和杂合型aabbRfrf两种，三对基因为隐性(aabbrfrf)时可作临保系，与纯合型不育系杂交能够生产全不育群体，然后利用全不育系与恢复系杂交生产杂交种(参见图1)。目前由该系统选育的三个国审双低杂交油菜品种“沪油杂1号”、“向农03”和“沪油杂4号”正在生产上大面积的推广，说明该不育系统具有广阔的应用前景与生产利用价值。

但是由于隐性核不育系是受到三对基因控制(aabbRfRf)，分离群体大，基因型多且复杂，导致测交与测交种鉴定的工作量大，选育难度很大。利用常规育种技术，隐性核不育系是以隐性核不育纯合两型系的形式应用于杂交种生产的，即隐性核不育系需要借助于纯合两型系兄妹交来繁殖和保存(图2)，为了使得纯合两型系中的不育株和可育株遗传背景一致，必须经过5代以上兄妹交，因此导致其选育周期长，而且在生产全不育系时需要在母本行中拔除纯合两型系中50％的可育株，影响全不育系的产量与质量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育系的方法，通过甘蓝型油菜小孢子培养技术，寻找一种简单、可行、高效技术能够快速获得隐性核不育系(基因型为aabbRfRf)。

由于通过甘蓝型油菜小孢子培养技术获得的DH隐性核不育株不能自交保存，需借助于甘蓝型油菜无性克隆技术保存并大量繁殖所得到的DH不育株。因此，本发明利用无性克隆技术，保存与扩繁依据本发明技术方案得到的DH隐性核不育系，直接将其用于隐性核不育杂交油菜育种中，从而摆脱了原有隐性核不育三系法制种时对隐性核不育纯合两型系的依赖，同时减少了全不育系生产时母本行中拔除纯合两型系内可育株的步骤，简化了生产步骤，提高了全不育系种子的纯度。

本发明所述的利用小孢子培养技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法，首先以优良的品种/系与隐性核不育系或临保系杂交，获得F₁代；然后以甘蓝型油菜小孢子培养技术对F₁代植株的游离小孢子进行诱导培养而获得DH株系；再以表现为不育的DH株系与临保系测交，测交种为100％不育，则对应的不育DH株系为本发明所述的隐性核不育系；然后借助于无性克隆技术保存并扩繁不育的DH株系，应用于杂交种生产。

所述方法具体包括以下步骤：