[发明专利]阪崎肠杆菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测阪崎肠杆菌的方法，以及用于该方法的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒和其制备方法。

背景技术

近年来，世界范围重大食品安全事件频频发生，疯牛病、葡萄球菌肠毒素牛奶中毒、苏丹虹、二恶英、三聚氰胺等事件对全球经济和社会政局稳定造成巨大影响。在诸多食品安全实践中，婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌污染备受关注。

阪崎肠杆菌(E.sakazakii)是近年来从奶粉(乳)制品中发现的、在一定条件下可使人致病的一种食源性致病菌，属于肠杆菌属肠杆菌科的一种周生鞭毛、能运动的革兰氏阴性无芽孢杆菌，1980年由黄色阴沟菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌是肠道正常菌群的一种，在一定条件下可引起人和动物致病。

阪崎肠杆菌在自然界的污染来源尚不清楚，但它在食品中分布较广泛，主要危害对象是婴儿，尤其是新生儿、早产儿、低出生体重儿或免疫力低下新生儿，可引起严重的菌血症、脑膜炎、小肠结肠炎、造成严重的神经系统后遗症和死亡，感染死亡率高达20-50％，在某些情况下可达40-80％。2004年世界粮农组织和世界卫生组织经过风险性评估将阪崎肠杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方奶粉A类致病菌。

世界粮农组织和世界卫生组织通报，在不同地区，婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌检出率在2-22.7％之间。因此，食源性阪崎肠杆菌污染已引起各国政府高度关注，加强了乳品生产及进出口环节检测，国外乳业巨头所生产产品曾因检出阪崎肠杆菌而被召回。阪崎肠杆菌的生物学特征和检测检验技术已成为学术界、政府和企业关注的热点，已建立了实时荧光定量PCR技术国际通用检测标准，我国于2005年由中国检验检疫研究院和天津检疫检验局牵头完成了《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准，并已实施。实时荧光定量PCR技术具有荧光定量PCR反应过程实时检测、荧光定量重复性好、基因分析稳定性好、荧光检测浓度梯度实验性范围宽、热循环升温快速、荧光定量在对数期进行定量分析等优势。其检测林敏度高、特异性强。但该方法还存在检测设备昂贵、操作技术要求高、样本污染易造成假阳性等不足。

目前检测阪崎肠杆菌的方法主要是通过常规生化鉴定、血清学检测和PCR测定法。

国际检测阪崎肠杆菌的标准生化方法是美国食品和药品管理局(FDA)的检测方法，对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌分离与计数，用“三管法”增菌可检测样品中微量的阪崎肠杆菌并定量，检测时至少需要333g样品。我国目前尚无该菌检测方法的国家标准，只有行业标准。其中改进的传统方法与FDA方法比较，检测结果一致，但效率大大提高，时间缩短了1/3～1/2。尽管如此，常规检测方法仍存在耗时较长，对检验员的要求较高，假阴性较高的弊端。

血清学检测成本低廉，易于操作，制备多克隆抗体可用于辅助常规生化检测，快速进行中毒诊断。我国国家标准目前仍然使用血清学鉴定的方法用于沙门氏菌、志贺氏菌的分型。血清学检测的缺点是易产生交叉反应，不适合作为独立的检测方法应用。

分子生物学尤其是PCR技术的发展给阪崎肠杆菌的快速检测提供了广阔的空间。除了普通PCR方法和荧光PCR方法，还有依据该菌生理生化特征建立的分子检测方法。随机扩增多态性DNA(RAPD)、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)、染色体DNA分析、核糖核酸分型以及质粒分型等也都已用于对阪崎肠杆菌分型研究。但PCR法检测费用昂贵，对仪器设备及检测环境的要求很高。

阪崎肠杆菌感染具有发病急，致死率高等特点，同时该菌的自然来源非常广泛，并且目前对其致病机制还不是很清楚，虽然近年来相关检测技术取得了很大的进展，但仍然存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源性致病菌感染的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常关键。

本发明采用阪崎肠杆菌免疫家兔或羊制备多表位抗体，免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒，本试剂盒可特异性的检测阪崎肠杆菌，检测快速(5-20分钟出结果)，可用于发病现场快速诊断。

本发明的公开

本发明的第一目的是：提供一种阪崎肠杆菌的检测方法，该方法为一步检测法，灵敏度高、特异性强，而且反应速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。

本发明的第二目的是：提供一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒，是针对阪崎肠杆菌检测提供的一种简便而且直接的一步法检测试剂盒，利用该试剂盒检测阪崎肠杆菌的灵敏度高、特异性强，速度快、操作简便，无需专门设施。