[发明专利]一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生问题，而且由于耐药菌株和新的致病亚型菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。所以开发新的抗菌药物成为一个越来越重大的研究课题。

抗菌肽( Antibacterial peptide，ABP) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide)，是生物体经诱导产生的一类具有多种生物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分, 具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点。天蚕素A是较早从惜古比天蚕中分离的抗菌肽，具有广谱的杀菌能力，耐高温且对真核细胞无毒副作用，其N端碱性很强，形成双亲a螺旋结构，N端序列对于其活性具有重要作用。由于天蚕素A由37个氨基酸残基组成，在体内应用时能引起免疫反应等问题，所以它不是发展为药物的理想候选者。Magainins 是1987 年由Zasloff 从非洲爪蟾的皮肤中分离出来的一类碱性无半胱氨酸的多肽，具有广谱抗性、亲水脂特性，有较低的溶血活性，不同于裂解肽Melittin和Bomhinin，后者具有高效的细胞溶血作用。一些其他种类的抗菌肽如防卫素和蜂毒素等，它们不是结构过于复杂，就是抗菌能力不足，或者是对真核细胞有毒性。

随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。本发明既是基于上述已知抗菌肽的优点人工设计的一种新型抗菌肽。

发明内容

本发明提供了一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用，可以解决现有技术存在的结构复杂、抗菌能力不足且抗菌谱不够广的问题。

本发明根据cecropin A和magainins的杀菌特点，自行设计了一种新型抗菌肽氨基酸序列。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌肽制剂。基因工程抗菌肽制剂可作为畜禽饲料添加剂或用于畜禽疾病的预防和治疗。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种基因工程抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。

可见本发明的抗菌肽序列结构简单，而且是一种杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。

进一步地，上述基因工程抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）抗菌肽基因的合成

根据cecropin A和magainin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区，引物扩增长度为250bp，

P1 : 5' —— AAGTGGAAATTGTTCAAGAA —— 3'

P2 : 5’ —— GCAAATGGCAT'TCTGACATCC ——3' ；

（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定

将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；

（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选

阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；

提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2 为引物进行PCR反应, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增出250bp的条带重组子定为阳性转化子；

（4）阳性克隆的诱导表达