[发明专利]一种基因工程抗菌肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种基因工程抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。

2.一种权利要求1所述的基因工程抗菌肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）抗菌肽基因的合成

根据cecropin A和magainin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区，引物扩增长度为250bp，

P1 : 5' —— AAGTGGAAATTGTTCAAGAA —— 3'

P2 : 5’ —— GCAAATGGCAT'TCTGACATCC ——3' ；

（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定

将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；

（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选

阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；

提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2 为引物进行PCR反应, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增出250bp的条带重组子定为阳性转化子；

（4）阳性克隆的诱导表达

将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时，取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD₆₀₀值为5-6，培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%，48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。

3. 权利要求1所述的基因工程抗菌肽用于制备抗菌肽制剂，具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入发酵罐，在28-30℃，500-1500r/min，pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM，溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h；

发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；

上述抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽半成品衍生的基因工程抗菌肽制剂。

4. 上述任一权利要求所述的基因工程抗菌肽作为畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗。