[发明专利]一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

目前，常用于检测病毒的方法有酶联免疫吸附反应(ELISA)、定性PCR技术和实时荧光定量PCR技术。ELISA灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性。定性PCR技术成本低、易于操作，但灵敏度比较低，且由于其扩增产物需通过凝胶电泳分析，极易产生污染。实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏度、高特异性且操作简便而被广泛应用。

实时荧光定量PCR技术是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其化学原理包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。

实时荧光定量PCR技术主要有以下三种荧光标记：

1)SYBR Green I：SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，区分非特异扩增，进一步还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响，同时，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。

2)分子信标：分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递(FRET)。由于“黑色”淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

3)TaqMan探针：TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因在3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTM II DNA聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法。即首先通过DNAstar软件在猪圆环病毒2型基因组内寻找保守序列，在获得的保守区域设计特异性引物和探针，然后通过扩增获得大量的目的片段。将目的片段和pGEM-T easy载体连接，取连接产物做模板，以设计好的特异引物做PCR检测。基于TaqMan探针特异性地结合于目的片段上，所以整个过程中监测到的荧光量的增加代表了目的片段的生成，保证了实验的特异性，以解决猪圆环病毒2型快速、准确检测问题。

本发明所述的猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

1)特异性引物和探针的设计和合成