[发明专利]一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)首先设计与合成特异性上、下游引物和探针：所述上、下游引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具体如下：

上游引物    5′-CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3′，

下游引物    5′-CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3′，

所述探针的序列如SEQ ID No 3所示，具体如下：

FAM-5′-CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3′-TAMRA；

2)目的片段的获得：配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段；

3)配制连接反应液；

4)转化并提取质粒模板；

5)定性PCR检测；

6)定量PCR检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：2×PCR Mix 10-13μl，上下游引物各0.9-1.3μl，基因组DNA 1-2μl，去离子水补加至总体积25μl；所述PCR反应程序为：94℃5min，94℃1min，52℃1min，72℃1min，72℃10min，30-40循环。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述连接反应液为2×快速连接缓冲液4-6μl，pGEM-T easy载体1μl，PCR产物1-3μl，T₄连接酶1μl，补加去离子水至总体积10μl。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定性PCR检测的反应体系为10×buffer 2.0-3.0μl，25mM MgCl₂ 2μl，dNTP 2μl，上下游引物各0.9-1.3μl，1.25U DNA聚合酶，模板1-2μl，去离子水补加至总体积25μl；所述定性PCR检测的反应程序为：94℃5min，94℃30S，60℃20S，72℃20S，72℃7min，25-35循环。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定量PCR检测的反应体系为：10×buffer 2.5μl，25mM MgCl₂ 4.5μl，dNTP 2.5μl，上下游引物各0.9-1.3μl，探针0.1-1.0μl，1.25U DNA聚合酶，模板DNA 1μl，去离子水补加至总体积25μl；所述定量PCR检测的反应程序：94℃10min，94℃15S，60℃40S，40-50循环。

6.权利要求1所述的检测方法在制备荧光定量PCR试剂盒中的应用。

7.权利要求1所述的检测方法在快速和定量检测猪圆环病毒2型中的应用。