[发明专利]人类白细胞抗原HLA-A、B基因全长序列测定以及HLA基因测序分型方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物医学及免疫遗传学，特别是涉及组织配型相关基因HLA-A、-B的全长序列测定以及HLA基因测序分型方法。

【背景技术】

人类白细胞抗原HLA(Human Leukocyte Antigen)分子提呈抗原肽给T淋巴细胞识别，在适应性免疫应答中起着极其重要的作用。HLA基因同时又是人类重要的遗传结构，在法医鉴定、器官移植配型等领域应用广泛。

众所周知，高度的多态性是HLA基因一个非常重要的特点。以往对人类白抗原基因多态性的研究主要是针对编码抗原结合肽的外显子(HLA-A、-B基因的第2-4外显子，HLA-DQB1、-DRB1基因的第2外显子)。众多研究者对这些外显子的分型技术、多态位点的探测、疾病相关性以及进化分析研究做了大量工作。

然而，越来越多的研究表明，HLA基因非编码区的多态位点及其功能也不容忽视。上世纪90年代，科学家们开始投入到对HLA基因的调控区特别是5’-启动子的多态性研究当中，并从进化、功能分析等多种角度揭示了这些位于调控区的SNPs在基因表达调控中的作用。大量研究表明，HLA基因调控区多态性蕴含了丰富的与基因进化、基因表达调控以及疾病相关联的信息。非编码区中除了调控区，内含子多态性也相当可观，它们对于测序分型试剂盒的开发及完善非常重要。HLA基因测序分型的PCR引物和测序引物，通常位于目的外显子(HLA-A、-B基因的第2、3、4外显子和HLA-DQB1、-DRB1基因的第2外显子)的侧翼即调控区及内含子内。某些等位基因的调控区及内含子中存在未知的变异，可能刚好位于现有分型试剂盒的引物结合位点，导致分型时对该等位基因漏检和丢失现象(Allele dropout)。因此要开发一种长久行之有效的分型试剂盒必须要掌握尽可能丰富的非编码区多态信息。

完整的HLA-A、-B基因的全长序列，应包含8个外显子、7个内含子、5’-启动子和3’-UTR。截止2010年1月世界卫生组织WHO(World Health Organization)的HLA因子命名委员会命名的HLA-A等位基因达965个，HLA-B等位基因有1543个(参见IMGT/HLA Database：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/al ign.html)，但是IMGT/HLA数据库中已公布包含5’-启动子和3’-UTR全长序列的HLA-A等位基因仅31种，占3.2％(31/965)；HLA-B等位基因有56种，占3.6％(56/1543)，相对于HLA-A、-B等位基因总数来说是微乎甚微的，完整的外显子、内含子特别是5’-启动子及3’-UTR两端调控区序列的缺乏，难以进行系统地HLA-A、-B基因全长序列多态性分析和HLA-I类基因精确分型试剂盒的研发，大量HLA-A、-B等位基因的全长序列有待填补。

以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际HLA基因分型的金标准。该方法首先对需要分型的外显子区域进行PCR扩增即首先扩增目的基因片段，然后对纯化的PCR扩增产物进行测序反应、电泳检测和序列分析。目前国内各HLA分型和临床组织配型工作中的HLA基因测序分型试剂普遍依赖于进口。但国际上不同厂家的测序分型试剂盒，扩增HLA基因目的片段的分子大小和策略有所不同。由于商品化试剂盒较为昂贵，限制了HLA基因测序分型在群体遗传学和骨髓库中的大规模应用。且大量新的点突变，被发现分布在HLA-A、-B基因的第1、5、6、7外显子内以及HLA-DRB1、-DQB1基因的第3外显子内(如DRB1*14:01:01和DRB1*14:54)并获得等位基因命名。在此情况下，增加这些外显子的多态性检测以解决模棱两可的结果迫在眉睫。