[发明专利]一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及拟南芥种子储藏蛋白基因2S albumin isoform 3(At2S3)的启动子与三个抗氧化基因重组提高种子抗氧化能力等种质改良中的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

作物种子是最基本的农业生产资料，是农业增产的内因，是各项技术措施的载体。禾谷类如玉米种子，种胚大、呼吸旺盛、易发热。胚部含脂肪多，易氧化酸败。而且胚部带菌量大，容易霉变。油料作物大豆种子吸湿性强，易丧失生活力，破损粒易生霉变质，导热性差，大量蛋白质在高温高湿条件下很容易老化变性。因此，种子贮藏是种子生产经营活动的重要环节，同时也是救灾备荒的重要措施。如果管理不善，会使害虫危害严重，导致种子的生活力降低，严重的会使种子霉烂，使农业生产受到很大损失。

种子特异启动子可以控制下游基因在植物种子中表达，避免外源基因在转基因植株中非特异表达所造成的能量和物质浪费，从而减少对其他重要农艺性状的不良影响。因此，利用种子特异启动子控制外源基因在种子中特异表达具有重要的理论和经济价值。

本发明人从拟南芥中分离到种子贮藏蛋白2S albumin isoform 3的基因At2S3的启动子序列。进一步构建启动子驱动的GUS报告基因、锰-超氧化物歧化酶基因MSD1，过氧化氢酶基因CAT1和维生素E生物合成中的关键酶尿黑酸植基转移酶基因HPT1三个抗氧化基因的植物表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥在种子相关器官(包括成熟种子、果夹和幼苗子叶)中高效表达GUS基因和三个抗氧化酶基因。筛选抗氧化酶基因表达均最高的株系，分别进行杂交，筛选、获得三价转基因种子。三价转基因种子内γ-维生素E(生育酚)含量比野生型提高45％；在含10μM百草枯(MV)的培养基上萌发率比野生型提高47％。该启动子可用于植物的种子基因工程，改良种子的抗氧化胁迫能力和品质。

(三)发明内容

本发明分离拟南芥种子特异基因At2S3的启动子，连接到植物表达载体上，利用脓杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，获得的转基因种子VE含量和抗氧化胁迫能力大大提高。

从拟南芥中通过PCR方法克隆得到At2S3启动子，插入到表达载体pBI121中GUS基因的上游，转化拟南芥。对转基因植株进行GUS染色和荧光活性测定，证明该启动子在种子相关器官中高效特异表达。

从拟南芥叶片中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法克隆得到编码锰-超氧化物歧化酶基因MSD1，过氧化氢酶基因CAT1和VE生物合成途径中的尿黑酸植基转移酶基因HPT1三个抗氧化酶基因。分别将三段基因序列插入到At2S3启动子下游，转化拟南芥。对转基因株系分别测定SOD和CAT酶活、Ve含量。选择SOD和CAT活性最高的株系进行杂交，得到双价转基因植株，再Ve含量含量最高的At2S3::HPT1转基因植物进行异花授粉，获得三价转基因植株。将单价、双价和三价转基因植株的种子进行氧化胁迫(MV)处理。与野生型相比，单价MSD转基因植株、双价和三价转基因植株的抗氧化胁迫能力明显增强。

根据上述技术，从拟南芥中分离的At2S3启动子驱动抗氧化基因单独和整合过量表达能提高种子的抗氧化胁迫能力，有望延长种子的贮藏期。如果连接耐盐或者抗旱基因可以提高种子出苗时的耐盐和抗旱能力；如果连接种子品质相关基因则可以提高种子的品质改良，具有重要的经济效益和社会效益。

(四)附图说明

图1是野生型和转基因种子内的生育酚含量。

(a)野生型和转基因株系(H3为例)的种子内生育酚组成及含量的高效液相色谱图。(b)野生型和相应转基因株系的种子内的生育酚含量。α、β、γ和δ是四种同分异构体。柱状图上方的不同字母表示在P＜0.05时差异显著。

图2是百草枯(MV)处理时野生型和转基因拟南芥的种子萌发状况

(a)、(b)分别是在含10μM MV的MS培养基上所有基因型的种子萌发5天后的照片和每天的萌发率统计结果。胚根伸长≥1mm时定义为种子萌发。标尺＝1mm。图中所示的At2S3::MSD、At2S3::CAT利At2S3::HPT的值均是各基因型五个株系的平均值。

图3是百草枯(MV)处理时野生型和转基因拟南芥的幼苗发育状况