[发明专利]调控胚胎干细胞及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及调控胚胎干细胞分化及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES)是由着床前囊胚内细胞团(Inner Cell Mass，ICM)的细胞在体外分离培养所建成的全能性细胞系。它具有自我更新和发育多能性的特点。一方面通过对称分裂而快速增殖，产生未分化的子代群体；另一方面，能够分化为包括体内三胚层细胞以及生殖细胞在内的多种类型的细胞。这两大特性使ES细胞具有极其重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景，可应用于早期胚胎发育过程的研究，药物毒物筛选，细胞移植治疗，基因治疗等领域。目前的研究表明，外源性LIF-STAT3和BMP-SMAD通路对于ES细胞维持自我更新具有至关重要的作用。在没有其他因子存在的无血清培养基中，仅仅添加LIF(leukemia inhibitor factor)和BMP4(bone morphogenetic protein 4)两种因子便可成功的在体外培养ES细胞。在这种条件下生长的ES细胞具有典型的ES细胞的所有特性。在ES细胞的多能性维持方面，除了外源性信号性分子起关键作用外，以转录因子Oct4，Sox2，Nanog为核心的转录因子调控网络对于ES细胞维持自我更新也具有至关重要的作用。这些转录因子的表达仅存在于早期胚胎发育过程中的多能细胞中，如ICM、Epiblast等。随着胚胎的进一步发育，这些多能细胞逐渐分化成成熟的组织细胞类型而丧失了多能性，而此时这些多能性相关的转录因子的表达也就随之消失。然而调控ES细胞胚层分化的分子机制目前研究不是很清楚，研究仅表明激活ERK-1/2通路可以触发ES细胞进行胚层分化，而抑制这条通路可以不依赖LIF部分维持ES细胞自我更新。但除了ERK-1/2通路以外，是否有其他信号通路参与调控ES细胞胚层分化目前并不清楚。

自我更新和分化多能性是胚胎干细胞的重要特性。但是，ES细胞从维持自我更新到胚层分化转变的分子调控机制目前研究并不清楚。

综上，本领域非常有必要研究其它相关的信号通路，以对ES细胞的发育和分化作出更深的了解。

发明内容

本发明的目的在于提供调控胚胎干细胞及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂。

在本发明的第一方面，提供钙调神经磷酸酶(Calcinuerin)-活化T细胞核因子(NFAT)信号通路的调节剂的用途，用于制备调节胚胎干细胞(ES)分化和胚胎(特别是早期胚胎)发育的组合物。

在另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，其用于制备抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。

在另一优选例中，所述的抑制剂选自(但不限于)：环孢素A(cyclosporine A，CsA)；FK506；VIVIT；GM6001；PP2；特异性干扰钙调神经磷酸酶基因表达的干扰分子(如siRNA)；特异性结合钙调神经磷酸酶的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的干扰分子是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列的分子。

在另一优选例中，所述的抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育包括：抑制胚胎干细胞进行胚层分化；维持胚胎干细胞自我更新。

在另一优选例中，所述的调节剂是促进剂，其用于制备促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。

在另一优选例中，所述的促进剂是一表达载体，其中含有钙调神经磷酸酶编码基因或活化T细胞核因子编码基因；或者，所述的促进剂是促进Ca²⁺信号通路的物质。

在另一优选例中，所述的促进胚胎干细胞分化和胚胎发育包括：促进胚胎干细胞进行胚层分化。

在另一优选例中，所述的早期胚胎是指发育0-4.5天的胚胎。

在另一优选例中，所述的钙调神经磷酸酶包括亚基：CnA(包括Ppp3ca、Ppp3cb、Ppp3cc)、CnB(包括Ppp3r1，Ppp3r2)；或

所述的活化T细胞核因子包括：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：与Erk1/2信号通路共同作用，激活下游靶基因Src或促进上皮-间充质细胞转换(EMT)。、

在另一优选例中，所述的钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路与Erk1/2信号通路共同作用激活下游靶基因Src或促进上皮-间充质细胞转换。

在本发明的另一方面，提供一种筛选(体外筛选)调节胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质的方法，所述的方法包括：