[发明专利]一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)原产中国，是深受人们喜爱的传统十大名花之一，名列全世界花卉消费量的前列，约占花卉销售总量的23％(陈俊愉，2001；Anderson，2005)。既可作为盆栽花卉(盆菊)、切花花卉(切菊)，也是城市园林绿化的地被花卉(地被菊)、还是重要的保健饮用花卉(茶用菊)。

植物再生方式主要为器官分化方式和体细胞胚发生方式(somaticembryogenesis)，体细胞胚发生方式与器官分化方式相比，具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点(Ammirato，1983；Gupta等，1993；Shinoyama等，2004；Mandal和Datta，2005))。同时体细胞胚的结构完整，一旦形成，一般可直接萌发形成小植株(李浚明，1992)。

植物的体细胞胚胎发生与器官发生是两个完全不同的生长、发育、分化过程。体细胞胚胎发生培养的细胞经历类似合子胚发生的阶段，形成非合子胚，再发育成成熟胚，最后萌发形成植株；而器官发生是由外植体或其形成的愈伤组织分化长出根、茎、叶等器官，再逐步形成植株的再生方式，在培养物上能看到典型的芽或根的结构(Haccius，1978；崔凯荣和戴若兰，2000)。

体细胞胚除了通过直接或间接方式诱导成苗和作为分子生物学研究的材料以外(Shinoyama等，2004；Mandal和Datta，2005)，胚状体发育及其植株再生系统也是最理想的基因转化受体系统。体细胞胚是由类似合子胚特性的胚性细胞发育而来，这些胚性细胞具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞；而且胚性细胞繁殖量大，同步性好，转化后的胚性细胞可顺利发育成胚状体及完整的转基因植株。大量研究表明，体胚发生多是单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少(Shinoyama等，2004；Mandal和Datta，2005)，因此，植物体细胞胚发生可作为理想的遗传转化受体体系(洪波等，2006；Blanc等，2006)。

体细胞胚发生还可用于植物种质资源库的建立，利于保存优良的植物种质资源和濒危植物资源(Laine和David，1992；Gupta等，1993；裴新梧和王亚馥，2000)。利用体细胞胚还可包装制作人工种子，进行植物离体快速繁殖、快速育苗和现代化的栽培、管理(Piccioni和Standardi，1995；Castillo等，1998；Ara等，1999；Saxena和Dhawan，1999；肖颖和王刚，2006)。利用体细胞胚也可进行植物体细胞无性系变异筛选，能分离优良的体细胞无性系变异变异，再通过体细胞胚发生形成完整的植株，得到植物新种质(品种)，从而克服传统育种中的一些缺陷，缩短育种周期，进行非常规育种(裴新梧和王亚馥，2000)。

在菊花的组织培养中，常见的再生方式是器官分化方式。但这种方式一方面需要大量的母株获取外植体；另方面再生速度慢，导致无性系的繁殖率降低；同时易产生变异，稳定性较差。因此对于大规模的菊花生产以及菊花的细胞工程和基因工程而言，利用器官分化途径的再生方式已远远不能满足需要。因此建立菊花间接体细胞胚发生的技术体系具有十分重要的意义。

菊花体细胞胚发生的最早报道是1991年May等利用菊花品种‘Iridon’叶片，在附加2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+9％～18％蔗糖的改良MS基本培养基上，获得了直接体细胞胚发生植株；并发现菊花体细胞胚的产生起源于单细胞；同时也发现菊花体细胞胚发生有较强基因型依赖性，在23个品种中有12个产生了体细胞胚，但只有5个品种获得了再生植株，且体细胞胚发生形成的再生植株的再生频率最大的只有9％。Pavingerova等(1994)以叶片(品种为‘WhiteSnowdon’)外植体通过液体和固体培养获得了体细胞胚，但体细胞胚发生形成的再生植株的再生频率最大的只有47％，同时体细胞胚发生也有较强的基因型依赖性；Tanaka等(2000)从菊花的管状花中诱导出了胚性愈伤，但体细胞胚发生频率最高只有56％；Mandal和Datta等(2005)也发现了菊花体细胞胚发生的基因型依赖和诱导频率较低的问题。综上所述，菊花体细胞胚诱导中存在的问题主要问题有：较强基因型依赖性，胚性愈伤组织分化率较低、体细胞胚发生形成的再生植株的再生频率较低，再生植株的稳定性较差等。

发明内容