[发明专利]一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法

权利要求书

1.一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、获得菊花无菌苗：将表面灭菌的菊花带腋芽茎段接种到以MS为基本培养基，添加了6-苄氨基嘌呤6-BA1.0mg/L、萘乙酸NAA0.1mg/L、质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH6.0的培养基上，诱导丛生芽；

2)从外植体诱导胚性愈伤组织：从步骤1)获得的无菌苗中切取外植体，接种到以MS为基本培养基，添加了激动素KT 1.0～2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5～1.0mg/L，质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0的胚性愈伤组织诱导培养基上，诱导胚性愈伤组织；

3)诱导胚性愈伤组织的分化：通过步骤2)获得的黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织后转入以MS为基本培养基，添加了激动素KT1.0～2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5～1.0mg/L，质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0的胚性愈伤组织分化培养基一上，再转接入以MS为基本培养基，添加了激动素KT 1.0～2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5～1.0mg/L、质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0的胚性愈伤组织分化培养基二上诱导菊花间接体细胞胚分化和由之再生成小植株；

4)获得体细胞胚再生植株：将步骤3)获得的再生植株接种到添加了0.1mg/L的萘乙酸NAA、质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0的1/2MS基本培养基上，进行生根培养，不定根长至1.0cm～2.0cm进行炼苗和移栽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS为基本培养基，添加了激动素KT 2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5mg/L，质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织分化培养基一为以MS为基本培养基，添加了激动素KT 2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5mg/L，质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织分化培养基二为以MS为基本培养基，添加了激动素KT 2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5mg/L、质量分数为0.75％的琼脂、质量分数为3％的蔗糖，pH 6.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中外植体在胚性愈伤组织诱导培养基上培养的时间为15d。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中胚性愈伤组织在胚性愈伤组织分化培养基一上培养的时间为15d，转接到胚性愈伤组织分化培养基二上继续培养20d。

7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述外植体为节间或叶盘。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中带腋芽茎段的表面灭菌包括：先在70％酒精浸泡30s后，用无菌水冲洗至少一次，再用0.1％升汞消毒1～2次，每次升汞消毒后无菌水冲洗至少一次。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述移栽包括取出试管苗，用清水洗净试管苗的根系后，移栽入由消毒泥炭与珍珠岩混合1∶1的基质中培养。

10.如权利要求1所述方法在菊花良种繁育和基因工程培育新品种中的应用。