[发明专利]基于纳米微粒的生物标志物的化学发光检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属生物检测技术领域，涉及重大疾病血清等生物样本中标志物的检测方法，具体涉及一种基于纳米微粒的生物标志物的化学发光检测方法及应用。本方法尤其能为临床肿瘤等重大疾病的早期诊断，提供高灵敏度血清等生物样本中标志物辅助判断依据。 

背景技术

世界卫生组织(WHO)统计，每年世界范围内有1000万人罹患癌症，死于癌症的人数约6万例左右，占全球死亡人数的12％。根据我国卫生部肿瘤防治办公室提供的我国肿瘤发病率和十大恶性肿瘤发病率排序显示：中国每年癌症新发病例约为220万人，因癌症死亡人数为160万人，平均每3分钟就有1.3人死于癌症，而且癌症的发病率呈急剧上升趋势。其中肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。据《文汇报》报道，在过去不到20年的时间内，我国癌症发病率上升69％，死亡率增长了29.4％，癌症已经成为威胁人类健康的第一杀手。治疗癌症早期诊断是关键。按目前的医疗水平，早期癌症病人约有80％-90％以上可以治愈，治疗后不仅能提高生存率，同时提高患者的生存质量，因此，早期诊断对于癌症患者具有十分重要的意义。 

肺癌是癌症当中最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率增长速度亦高居各恶性肿瘤之首。现有技术公开了肺癌分为小细胞肺癌(smallcell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80％。由于肺癌起病隐匿，目前仍缺乏有效的筛查和早期诊断方法。临床实践显示，患者出现症状时多为晚期，预后较差，总的5年生存率不超过15％，有症状者≤10％。有研究显示，在早期诊断的肺癌患者中，手术治疗的预后较中晚期肺癌明显改善，其生存率可达70％。临床传统的诊断方法有胸片、支气管镜、痰细胞学检查等方法，但均缺乏足够的特异性和敏感性，大多数肺癌患者确诊时已为晚期。因此，临床急需一种能够早期诊断肺癌、适合普遍推广的超高灵敏度的新技术。 

近年来，在肺癌的辅助诊断方面，肿瘤标志物的研究十分活跃。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类抗原物质。它具有高效、高灵敏、方便、标本易获取及创伤小等优点，因此检测、筛选及鉴定肿瘤标志物一直是肺癌早期诊断研究的研究重点。 

现有技术的肿瘤标志物检测一般采用放射或酶联免疫试剂盒，这些检测方法普遍存在检测灵敏度低，导致所需血清用量大、患者顺应性差、检测仪器成本高、维护费用高等不足，从而不利于它们在基层中小医院临床上的应用。生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，具有高通量、微型化和自动化等特点，是医学检测的重要发展方向之一，但目前离临床常规使用还有一段距离。 

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术检测生物标志物方法中检测灵敏度低、血清用量大、检测仪器复杂和诊断费用高等的不足，提供一种重大疾病血清等生物样本中标志物的新的检测方法，具体涉及一种基于纳米微粒的生物标志物的化学发光检测方法及应用。 

本发明方法中，在聚苯乙烯96孔板上共价固定特异性识别单克隆抗体，与相应的标志物结合，再与针对该标志物的适配体修饰的金纳米微粒进行夹心反应；随后采用NH₂OH/HAuCl₄放大经免疫反应结合的金纳米微粒，进行标志物的高灵敏度化学发光检测。本发明方法能够识别、检测多种重大疾病标志物。 

具体而言，本发明的基于纳米微粒的生物标志物的化学发光检测方法，其特征在于，其包括步骤： 

1)将包被抗体结合到聚苯乙烯96孔板上制备载体抗体复合物，封闭备用； 

2)制备金纳米微粒； 

3)制备链霉亲合素修饰的金纳米微粒； 

4)制备针对目标抗原适配体DNA修饰的金纳米微粒； 

5)NH₂OH/HAuCl₄放大后，加入鲁米诺、AgNO₃底物进行化学发光测定。 

本发明中，使用聚苯乙烯96孔板作为载体结合包被抗体，与标准溶液或者血清等生物样本中的标志物结合后，加入适配体修饰的金纳米微粒，形成三明治复合物，经NH₂OH/HAuCl₄放大后，进行化学发光定量测定； 

本发明中，所述标志物的一端与包被抗体结合，另一端与针对该标志物 的适配体修饰的金纳米微粒结合；