[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，还涉及该试剂盒的检测方法。

背景技术

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一个主要血清型，感染该菌可使人患腹泻和出血性结肠炎，也可引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。

EHEC O157:H7感染的死亡率之所以高居不下，主要原因之一就是EHECO157:H7难以在早期被快速、准确地检测出来。目前，临床上对EHEC O157:H7主要采用传统的增菌培养、分离提纯、生化实验和血清学实验进行检测，存在操作繁琐、费时等缺点。近年来已有文献报道采用PCR、酶谱分析、高效液相色谱分析、代谢指纹法等新技术检测EHEC O157:H7，但这些方法存在特异性不强、假阳性结果较高等缺点。因此，建立一种准确、快速的EHEC O157:H7检测方法，是临床的迫切需求。

核酸分析，尤其是核酸原位杂交，作为一种准确、快速的分析方法，近年来在病原菌鉴定方面受到越来越多的关注。其基本原理是将带有发光标记物的能够识别特定核酸序列的寡核苷酸探针与待测核酸样本进行杂交反应，将杂交反应结果转化为可以读取的光信号，从而实现对待测核酸样本中特定核酸序列的定性或定量检测。传统的发光标记物多采用有机荧光染料，但其存在荧光强度弱、检测灵敏度较低；不同荧光染料的光谱间干扰严重，检测特异性较弱；光漂白现象明显，检测重复性较差等缺点，使荧光核酸杂交技术的发展和应用受到一定限制。

量子点(QDs)的出现为克服以上问题带来了希望。量子点是一种由周期表中II-VI族或III-V族元素组成，直径在1～10nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有许多独特的理化特性：①发射波长可调谐，可以通过控制量子点的粒径大小来调节其发射荧光的颜色；②激发波长范围宽，从紫外区到近红外区，可以用同一波长的光激发不同发射波长的量子点；③发射峰狭窄且对称，半峰宽通常为25～45nm；④荧光强度高且稳定，对光漂白有强烈的抵制作用。由于这些独特的量子优势，近年来将量子点应用于荧光材料的替代研究更为深入，范围不断扩展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，目的之二在于提供所述EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒的检测方法，以满足临床对准确、快速检测EHEC O157:H7的迫切要求。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、EHEC O157:H7多色量子点快速检测试剂盒，包含以下试剂：

①固定在固相载体上的捕获探针；

②三种分别用荧光发射波长互不重叠的量子点标记的检测探针：O157抗原编码基因rfbE探针、溶血性基因HlyAB探针和志贺毒素基因stx2探针；

③核酸样本的PCR扩增引物A组或B组：所述PCR扩增引物A组用于扩增分别包含O157抗原编码基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段和志贺毒素基因stx2片段中的一种、以及与捕获探针结合片段的PCR产物；所述PCR扩增引物B组用于扩增同时包含O157抗原编码基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段、志贺毒素基因stx2片段、以及与捕获探针结合片段的PCR产物。

在本发明中，捕获探针用于捕获PCR产物，其与PCR产物中与捕获探针结合片段的核苷酸序列互补，二者可通过杂交结合，从而将PCR产物捕获至固相载体上。在实际应用时，捕获探针和与捕获探针结合片段的核苷酸序列可根据需要进行选择和优化，优选地，与捕获探针结合片段的序列为EHEC 16S rDNA保守序列，捕获探针的序列为EHEC 16S rDNA保守序列的互补序列。EHEC 16SrDNA保守序列具有种属特异性，可进一步增强本发明的检测特异性。