[发明专利]一种乙型脑炎疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙型脑炎疫苗的生产方法，具体涉及一种利用生物反应器生产灭活病毒乙型脑炎疫苗的方法。

背景技术

传统的灭活病毒疫苗，例如乙型脑炎疫苗的生产工艺多采用转瓶、固定床和多台小型反应器并联工艺来培养细胞和病毒，该工艺存在着生产能力不足、产品质量不稳定等诸多缺陷，限制了病毒疫苗的工业化生产和临床应用。目前，采用生物反应器技术进行细胞和病毒的培养已经成为国际上病毒疫苗研发的热点，法国巴斯德研究所应用500L生物反应器已经成功地工业化生产出Vero细胞狂犬疫苗和小儿麻痹疫苗，取得了显著的经济效益和社会效益。因此，对利用生物反应器生产乙脑疫苗的工艺进行深入的研究，进而实现工业化生产具有广阔的前景和积极的意义。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种利用生物反应器生产灭活病毒乙型脑炎疫苗的方法，该方法的生产能力显著提高且产品质量更加稳定均一。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种乙型脑炎疫苗的生产方法，该生产方法包括以下步骤：

(1)将Vero种子细胞加入300升生物反应器中，与微载体一起进行灌流培养，其中培养基包含9.55g/L的M199(M199干粉培养基组成成分见GIBCO培养基手册)、2.2g/L的NaHCO₃、1.5g/L的葡萄糖、0.2g/L的谷氨酰胺以及10％(体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括：搅拌速度为35～40转/分，pH为7.2～7.4，溶解氧为40～50％饱和度，温度为36.5～37.5℃，培养基的灌流速度为315升/天；

(2)灌流培养5～6天后，沉降微载体和细胞，以维持液替换培养基，接种乙型脑炎病毒继续进行灌流培养，其中维持液包含9.55g/L的M199培养基，2.2g/L的NaHCO₃，1.0g/L的蔗糖以及0.1g/L的人血白蛋白；培养条件包括：搅拌速度为35～40转/分，pH为7.5～7.6，溶解氧为40～50％饱和度，温度为33.5～34.5℃，维持液的灌流速度为315升/天；

(3)收集病毒培养液，过滤、灭活并纯化。

在上述生产方法中，优选地，乙型脑炎病毒按照感染复数(MOI)为0.01接种。

在上述生产方法中，Vero种子细胞的制备方法可以包括以下步骤：将复苏的Vero细胞依次在175cm²方瓶、2升转瓶、14升生物反应器以及75升生物反应器中培养。

优选地，175cm²方瓶中的培养基为包含10％(体积/体积)的胎牛血清的M199培养基；培养条件包括：温度为37℃，通入5％(体积/体积)的CO₂。更优选地，175cm²方瓶中的培养方法为将液氮保存的细胞迅速融化后，按1×10⁵/cm²的接种密度转入175cm²方瓶中，滴加培养基并在37℃和5％(体积/体积)的CO₂下培养，长至致密单层后消化，再以1∶4(体积/体积)的接种比例将经消化得到的细胞悬液加到新的培养基中，在37℃和5％(体积/体积)的CO₂下培养3～4天后，再以1∶4(体积/体积)接种比例加到新的培养基中，在37℃和5％(体积/体积)的CO₂下培养3～4天。

优选地，2升转瓶中的培养基包括9.55g/L的M199培养基、1.8g/L的NaHCO₃、1.5g/L的葡萄糖、0.2g/L的谷氨酰胺以及10％(体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括：温度为37℃，转速为1/8转/分。更优选地，2升转瓶中培养的接种密度为1.0～2.0×10⁵/cm²，培养时间为3～4天。

优选地，14升和75生物反应器中的培养基包括9.55g/L的M199培养基、2.2g/L的NaHCO₃、1.5g/L的葡萄糖、0.2g/L的谷氨酰胺以及10％(体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括：搅拌速度为35～40转/分，pH为7.2～7.4，溶解氧为40～50％饱和度，温度为36.5～37.5℃，培养基的灌流速度为315升/天，并且加入微载体。

在上述生产方法中，优选地，过滤包括依次经过孔径为1μm和0.45μm的滤膜过滤，再经过截留分子量为300KD的滤膜超滤。