[发明专利]一种乙型脑炎疫苗的生产方法

权利要求书

1.一种乙型脑炎疫苗的生产方法，该生产方法包括以下步骤：

(1)将Vero种子细胞加入300升生物反应器中，与微载体一起进行灌流培养，其中培养基包含9.55g/L的M199培养基、2.2g/L的NaHCO₃、1.5g/L的葡萄糖、0.2g/L的谷氨酰胺以及10％(体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括：搅拌速度为35～40转/分，pH为7.2～7.4，溶解氧为40～50％饱和度，温度为36.5～37.5℃，培养基的灌流速度为315升/天；

(2)灌流培养5～6天后，沉降微载体和细胞，以维持液替换培养基，接种乙型脑炎病毒继续进行灌流培养，其中维持液包含9.55g/L的M199培养基，2.2g/L的NaHCO₃，1.0g/L的蔗糖以及0.1g/L的人血白蛋白；培养条件包括：搅拌速度为35～40转/分，pH为7.5～7.6，溶解氧为40-50％饱和度，温度为33.5-34.5℃，维持液的灌流速度为315升/天；

(3)收集病毒培养液，过滤、灭活并纯化。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述乙型脑炎病毒按照感染复数为0.01接种。

3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述Vero种子细胞的制备方法包括以下步骤：将复苏的Vero细胞依次在175cm²方瓶、2升转瓶、14升生物反应器以及75升生物反应器中培养。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述175cm²方瓶中的培养基为包含10％(体积/体积)的胎牛血清的M199培养基；培养条件包括：温度为37℃，通入5％(体积/体积)的CO₂。

5.根据权利要求3或4所述的生产方法，其特征在于，所述175cm²方瓶中的培养方法为将液氮保存的细胞迅速融化后，按1×10⁵/cm²的接种密度转入175cm²方瓶中，滴加培养基并在37℃和5％(体积/体积)的CO₂下培养，长至致密单层后消化，再以1∶4(体积/体积)的接种比例将经消化得到的细胞悬液加到新的培养基中，在37℃和5％(体积/体积)的CO₂下培养3～4天后，再以1∶4(体积/体积)接种比例加到新的培养基中，在37℃和5％(体积/体积)的CO₂下培养3～4天。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述2升转瓶中的培养基包括9.55g/L的M199培养基、1.8g/L的NaHCO₃、1.5g/L的葡萄糖、0.2g/L的谷氨酰胺以及10％(体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括：温度为37℃，转速为1/8转/分。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述2升转瓶中培养的接种密度为1.0～2.0×10⁵/cm²，培养时间为3～4天。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述14升和75生物反应器中的培养基包括9.55g/L的M199培养基、2.2g/L的NaHCO₃、1.5g/L的葡萄糖、0.2g/L的谷氨酰胺以及10％(体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括：搅拌速度为35～40转/分，pH为7.2～7.4，溶解氧为40～50％饱和度，温度为36.5～37.5℃，培养基的灌流速度为315升/天，并且加入微载体。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述过滤包括依次经过孔径为1μm和0.45μm的滤膜过滤，再经过截留分子量为300KD的滤膜超滤。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述灭活的灭活剂为β-丙内酯。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述纯化的方法为分子筛层析和/或离子交换膜层析。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述微载体的用量为每升培养基5.0g。