[发明专利]一种采用DNA为探针的电化学检测环境污染物方法

说明书

技术领域

本发明属于生化分析和生物传感领域，特别是涉及DNA电化学传感器检测环境中基因毒性化合物的方法。

背景技术

DNA传感器检测主要分为靶DNA检测和DNA突变测定两种。这些测定在人类疾病诊断、环境中病原体检测、食品安全、检疫等方面有广泛的应用。

随着人们对环境安全及身体健康的日益关注，迫切需要能对各种重大疾病进行早期诊断和治疗，迅速对周边环境进行安全评价。然而，目前对环境中具有基因毒性物质的筛查检测，主要通过动物试验和细胞毒理学评价来得到其毒性强弱的数据，此方法费用高昂、周期长，不适合大批量化合物的毒性筛查。气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)，可以对已知基因毒性化合物定性定量，然而其设备大型昂贵很难实现现场检测，且检测项目单一，通量小，样品前处理复杂耗时。另外，色谱-质谱联用的方法无法对未知化合物和新化合物可能的毒性效应进行评价。

由于动物试验和色谱-质谱联用实验存在的缺点，20世纪70年代以后，国内外学者开始利用微生物传感器来检测基因毒性物质引起的DNA损伤或序列改变，主要有Ames法，SOS显色反应等及其从中衍生出来的方法。然而，Ames法检测假阳性高；SOS显色反应灵敏度不够。

本发明所使用的DNA电化学传感器结合了DNA和电化学的优点，总体来说，包括以下几个方面的优势：1)、特异性好，DNA分子双链之间通过特定的碱基配对而具有非常高的特异性识别能力。2)、稳定性好，离体DNA比多数蛋白质(酶)分子的热稳定性好，制成的传感器可以保存较长时间。3)、制备简单，可以大批量合成。4)、电化学响应快，操作比较简便。5)、灵敏度高，成本低廉，适合大批量筛查检测。

然而电化学方法直接检测DNA产生的响应信号较低，微弱的响应信号容易受到噪声干扰，发生基线偏移，降低了仪器的灵敏度。而环境中基因毒性化合物的浓度低，引起的电信号变化不明显。

本发明使用信号分子探针增大DNA电化学传感器的灵敏度，使得低至皮摩尔浓度的基因毒性化合物产生的电信号变化也能够被检测到。

本发明提供了一种简易、快速而灵敏的基因毒性化合物的筛选方法，不仅可以评价已知基因毒性化合物毒性强弱；还可以评价未知化合物的毒性效应；筛查实际样品中是否含有基因毒性化合物。仪器设备小型廉价，检测通量大，样品前处理简单，适合现场快速筛查检测。可直接应用于食品和环境样品的现场筛查与检测，达到经济、灵敏、准确和快速大批量筛查的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作方便、检测灵敏度高、结果准确可靠，并且能够用于现场筛查检测环境污染物尤其是基因毒性化合物的生物传感器检测方法。用于基因毒性化合物筛查的DNA电化学传感器，应用其对目标分析物检测，结果准确可靠，步骤简单，灵敏度高，适合大批量样品的现场筛查。

核酸传感器检测基因毒性化合物的原理：基因毒性化合物与核酸传感器上的固载DNA作用后，通过与双链DNA非共价结合、DNA碱基损伤等方式会引起DNA双链的结构或配对的细微变化，上述变化通过在双链DNA上引入与DNA特异性结合的电化学活性分子亚甲基蓝(MB)能够进行信号放大。通过记录核酸传感器与基因毒性化合物作用前后的电信号变化可以判断目标分析物是否具有基因毒性及其毒性大小。对于单一的目标分析物，该核酸传感器的信号变化强度与目标分析物的浓度在一定范围内线性相关。对于水、土壤、食品、空气、烟道气等复杂的目标样品，该核酸传感器能够快速筛查目标样品中是否含有基因毒性化合物。该核酸传感器还可以通过与毒性已知的化合物的比对实验评价新合成或毒性未知的化合物的毒性效应。

本发明使用的DNA捕获探针和封闭剂(巯基己醇)通过末端标记的巯基固定在金电极表面。互补靶核酸片段在15～30℃与金电极上固载的DNA捕获探针在缓冲体系(pH 7.0)中反应1～2小时。

本发明在核酸传感器的检测溶液中加入与核酸传感器特性结合的具有氧化还原活性的信号分子亚甲基蓝(MB)，增加了电极的响应电流信号。

本发明检测的非水溶性已知化合物在助溶剂N，N-二甲基甲酰胺的作用下溶于检测体系进行电化学检测分析。未知化合物通过电化学分析检测，其检测结果与六氯苯的检测结果对比评价未知化合物的基因毒性效应。目标分析物为实际样品时，可以通过电化学分析检测确定样品中是否含有基因毒性化合物。

本发明的检测方法包括以下步骤

a).将单链DNA捕获探针的一端固定在电化学装置的工作电极表面，得到核酸捕获探针，采用封闭剂与工作电极表面的剩余位点结合；