[发明专利]一种检测都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及念珠菌的检测领域，具体而言，涉及一种检测都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒。

背景技术

都柏林念珠菌(Candida dubliniensis，又名杜氏假丝酵母菌)，属于半知菌亚门芽抱菌纲隐球酵母目隐球酵母科念珠菌属，是一种芽管和厚壁孢子阳性的机会致病酵母菌，是1995年7月才被公认的一个新菌种。都柏林念珠菌分离自免疫力极其低下的HIV感染者，感染部位以口咽部居多。随着对都柏林念珠菌研究的增多，在感染者的其他部位如阴道、肺部、血液、心脏等也都发现了都柏林念珠菌。

近年来，由于广谱抗生素的广泛应用、肿瘤化疗、器官移植的开展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由都柏林念珠菌等非白念珠菌引起的深部念珠菌感染日益增多。随着不断地研究发现，都柏林念珠菌很容易对氟康唑产生不可逆的耐药性，体外培养过程也发现其会很快产生对常用抗真菌药物的耐受，但由于都柏林念珠菌的表型特征(如菌落颜色、形态及染色形态)及生化特征均类似于白念珠菌，临床上常常将其误认为是白念珠菌，对患者采用抗菌药物治疗后将会产生严重的药物耐受性，直接危及患者的生命。因此，快速、准确地将白色念珠菌和都柏林念珠菌鉴别开来，对于念珠菌感染性疾病的确诊及制定有效的治疗方案十分重要。

当前临床上主要通过表型鉴定都柏林念珠菌和其他念珠菌，表型鉴定包括芽管试验、厚膜孢子形成试验、CHROM agar显色、微生物自动鉴定系统API 20C AUX、同化试验、45℃温度试验等，这些方法均可在一定程度上鉴定都柏林念珠菌和白念珠菌，但由于两者表型相似，上述方法在敏感性和特异性方面都不理想。下面就针对目前常用的念珠菌检测方法作以下简要阐明：

(一)传统检测方法，包括常规涂片镜检法以及培养法。

1.常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉，但它只能区分念珠菌与其他球菌，无法将都柏林念珠菌和白念珠菌区分开来。

2.培养法：是目前临床上确定念珠菌诊断和治疗方案的重要依据，但临床上不同的念珠菌在沙氏培养基上生长均呈现白色菌落，所以要区分都柏林念珠菌和白念珠菌，还必须要做念珠菌的厚壁孢子试验和芽管试验，大量的实验证明，都柏林念珠菌与白念珠菌在48小时内均可形成厚壁抱子，白念珠菌厚壁抱子一般呈单个顶生，都柏林念珠菌厚壁抱子数量较多，一般呈双顶生或簇生，但这些特点并不稳定存在，所以还是不能准确、有效地区分都柏林念珠菌和白念珠菌。

也有人采用科玛嘉(CHROMagar)培养基，该培养基含有特殊显色物质，在37℃培养48小时后，都柏林念珠菌呈现出墨绿色的菌落，而白色念珠菌则呈现淡绿色的菌落，然而，由于都柏林念珠菌在科玛嘉(CHROMagar)培养基上多传几代后，其墨绿色的菌落逐渐会变为淡绿色，因而采用该方法也不能很好的区分出都柏林念珠菌。

(二)仪器自动化分析鉴定系统

随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定进入了基于生理生化的仪器自动化分析的鉴定系统阶段。近年来，相关的酵母菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等。这些快速鉴定系统大多数是应用于临床酵母菌的鉴定，能鉴定的酵母菌种类较少，只适合做基础性研究，不利于中小型医院的推广使用。

(三)免疫学测定：乳胶凝集反应、放免测定以及酶联免疫吸附测定，也可以作为念珠菌的辅助检测手段，但它们的敏感性和特异性均较差，无法成功地将都柏林念珠菌和白念珠菌区分开来。

(四)念珠菌的现代分子生物学检测：近年随着分子生物学的发展。基因分型技术因具有良好的稳定性、重复性和准确性已广泛应用于病原微生物检测，大致包括测定真菌染色体DNA中GC含量、染色体组型技术、DNA探针杂交技术、随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和DNA序列分析等。RAPD分型法，又称任意引物聚合酶链反应(Arbitrarily primed PCR)，AP-PCR)，是一种以PCR为基础揭示基因组多态性的方法。该方法目前在日常医院感染的监测与预防控制中占主导地位，但存在分辨率低、影响因素多、重复性较差等诸多不足。

由此可见，如何设计出一种快速鉴别都柏林念珠菌的方法及途径，便于临床上快速检测出都柏林念珠菌，从而及时有针对性地对都柏林念珠菌用药，是临床上急需解决的问题。

发明内容