[发明专利]一种表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高效表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌工程菌、其构建方法及诱导培养方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)是一种高效、无毒的天然防腐剂，也是唯一一种可作为防腐剂应用于食品的细菌素。Nisin又称乳酸链球菌肽，是由乳酸链球菌产生的一种多肽物质，它能有效抑杀嗜热脂肪芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭菌、乳酸菌等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的灭菌温度、缩短食品灭菌时间，使食品保持原有营养成份、风味、色泽，同时还可节约大量能源。可广泛应用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐装食品、果汁饮料及经热处理密闭包装食品的防腐保鲜，同时也可应用于化妆品和医疗保健品等领域。

乳铁蛋白肽(LFcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多肽，广泛存在于动物的乳汁、体液、泪液、唾液、血浆、中性粒细胞及多种组织中。具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、调节机体免疫、促进骨细胞生长等多种生物功能，在众多的功能中，抗菌功能是最引人注目的，而对真核细胞几乎没有毒性。且牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)的抗菌活性较其它的乳铁蛋白肽活性高具有很好的应用前景。

Nisin应用前景广阔，但也存在局限性，如不能够抑制G-菌、酵母菌以及霉菌，在中性及碱性环境中溶解度低、不稳定而且抗菌效果大大降低等，因此扩大nisin抗菌谱的研究不仅具有理论价值，而且具有十分重要的应用价值。

本发明针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点，选择抗菌谱较广且具有较强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料，构建融合基因nisin-rbLF-N，并在毕赤酵母GS115宿主中进行表达，获得具有较广抗菌谱的融合蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种能在大肠杆菌中高效表达的重组nisin-rbLF-N融合基因。

本发明的另一目的是提供一种含有所述重组nisin-rbLF-N融合基因的表达载体。

本发明的再一目的是提供能够高效表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。

本发明的进一步目的是提供所述大肠杆菌工程菌的诱导培养方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种融合基因，其含有编码乳酸链球菌素的nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。

前述的融合基因为Nisin-rbLF-N，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供含有上述融合基因的表达载体，优选地，其出发载体为pGEX-4T1。

本发明还提供含有上述表达载体的工程菌。优选地，所述工程菌为大肠杆菌BL21。

本发明另外提供构建上述大肠杆菌BL21工程菌的方法。

根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，并在5’端和3’端设计EcoRI和BamHI酶切位点，将优化后的nisin基因克隆于pMD19-T载体。根据目的序列分别设计引物。在上游引物设计酶切位点BamHI(下划线标记)和保护碱基。

上游引物F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

下游引物R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’。

根据牛乳铁蛋白cDNA序列，设计引物。在上游引物设计与nisin互补配对的序列(下划线标记)，下游引物设计酶切位点EcoR I(下划线标记)、终止密码子和保护碱基。

上游引物F2：5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’；

下游引物R2：5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。