[发明专利]一种表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌工程菌

权利要求书

1.含有nisin-rbLF-N融合基因的表达载体，所述nisin-rbLF-N融合基因含有编码乳酸链球菌素的nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。

2.如权利要求1所述的表达载体，所述nisin-rbLF-N融合基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为pGEX-4T1。

4.含有权利要求1-3任一项所述表达载体的工程菌。

5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌BL21。

6.构建权利要求5所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，将优化后的nisin基因克隆于pMD19-T载体，以合成的pMD19-T/nisin质粒为模板，用引物F1、R1进行PCR扩增nisin基因，纯化回收PCR产物；以从牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增rbLF-N基因，纯化回收PCR产物；以纯化回收后的nisin基因和rbLF-N基因为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因，纯化回收PCR产物；

其中，F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’；

F2：5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’；

R2：5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’；

2)将步骤1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到载体pGEX-4T1中；

3)将步骤2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pGEX-4T1载体转入大肠杆菌BL21中，然后进行重组克隆的筛选，获得重组大肠杆菌BL21工程菌。

7.权利要求5所述工程菌的诱导培养方法，包括如下步骤：

1)挑取重组大肠杆菌BL21的白色菌落接种于含Amp^r的LB液体培养基中37℃过夜培养；

2)按5v/v％的接种量将步骤1)过夜培养的菌液接种于LB液体培养基中，于37℃扩大培养至菌液OD₆₀₀值达0.6～0.8；

3)向步骤2)培养得到的菌液中加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L，继续培养4h，离心收集菌体。

8.权利要求5所述工程菌表达的nisin-rbLF-N重组蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

1)用超声波冰浴破碎重组大肠杆菌BL21的菌体，提取并溶解含有nisin-rbLF-N重组蛋白的包涵体；

2)将步骤1)得到的包涵体进行梯度透析，得到复性的nisin-rbLF-N重组蛋白。

9.如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)向重组大肠杆菌BL21的菌体中加入磷酸盐缓冲液PBS及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有nisin-rbLF-N重组蛋白的包涵体；将得到的悬浊液用超声波冰浴破碎2次，然后用水洗涤2次，得到包涵体蛋白；

所述磷酸盐缓冲液PBS含有150mmol/L Tris-HCl，32mmol/LNa₂HPO₄，4mmol/L NaH₂PO₄，pH值为7.3；

2)将步骤1)得到的包涵体蛋白用8mol/L尿素溶解，采用浓度梯度透析复性，复性透析溶液I至VI分别是6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素与20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl配制的pH值8.0的溶液，各浓度的复性透析溶液透析8h，复性后的溶液于5000×g，离心20min收集上清。