[发明专利]一种表达弹性蛋白酶2B的基因工程菌、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达人源弹性蛋白酶的基因工程菌、其构建方法及应用。

背景技术

弹性蛋白酶(elastase)是以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的一类广谱蛋白水解酶，在食品、医药、日化及环保领域有重要的开发前景。目前国内弹性蛋白酶的生产方法主要是从动物的胰脏中提取，受到脏器材料及生产工艺的限制，成本较高，产量较低，大大落后于市场需求，限制了弹性蛋白酶的应用推广。国内外广泛开展利用微生物发酵生产弹性蛋白酶，在一定程度上缓解了工业用酶，如肉类嫩化剂、化妆品添加剂等方面的需求，但作为医用生化药物仍然有很大的局限，这主要是由于微生物发酵生产的弹性蛋白酶在生物安全性及毒理方面还有一定的不足，另外不同微生物来源的弹性蛋白酶性质有一定差别，距离医用生化药物商品生产有一定的距离。

本发明利用基因工程技术，通过反转录克隆了人肾脏组织中的弹性蛋白酶2B(elastase 2B，ELA2B)基因，利用毕赤酵母表达系统对其进行表达，使大规模生产安全的人源弹性蛋白酶成为可能，同时为人源弹性蛋白酶的结构和性质研究提供了实验材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效表达人源重组弹性蛋白酶2B的基因工程菌。

本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明的进一步目的是提供上述基因工程菌在生产人源重组弹性蛋白酶中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种表达弹性蛋白酶2B的基因工程菌，其出发菌株为毕赤酵母。优选地，其出发菌株为毕赤酵母GS115。

上述基因工程菌的构建方法，其包括步骤：1)从人体肾脏组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到ELA2B基因；2)将步骤1)中得到的ELA2B基因插入到表达载体中；3)将步骤2)中构建的表达载体转入毕赤酵母，并筛选阳性克隆，得到重组毕赤酵母工程菌。

前述的方法，其中所述表达载体的出发载体为pPIC9K，即将所述弹性蛋白酶2B基因克隆到pPIC9K的多克隆位点而获得。

将上述表达载体转入毕赤酵母的方法可以是电转化法，也可以采用本领域技术人员所熟悉的任何将表达载体转入酵母细胞的方法，例如氯化锂转化法、PEG法等。

前述的方法，其中步骤3)中所述筛选阳性克隆包括：用MD培养基初步筛选阳性克隆，再用G418抗性进行二次筛选，得到具有弹性蛋白基因高拷贝数的克隆，最后采用酪蛋白-MM平板诱导法，筛选得到高分泌表达的重组菌株。

前述的方法，其中所述所述弹性蛋白酶2B基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该序列可由产弹性蛋白酶的人肾脏组织中的弹性蛋白酶2B(elastase 2B，ELA2B)基因为模板克隆得到。

本发明通过基因工程的方法构建人源弹性蛋白酶2B毕赤酵母表达系统，即将人源弹性蛋白酶2B基因克隆到载体中，利用酵母表达载体系统，在酵母细胞中表达外源弹性蛋白酶。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。此外，它对外源蛋白具有很高的表达量和高分泌性，能够进行翻译后加工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。

更具体地说，可通过如下方法构建高效表达人源弹性蛋白酶2B的基因工程菌：

采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从人体肾脏组织中提取的总RNA中扩增得到ELA2B基因。然后对PCR产物进行T-A克隆，获得质粒pGEM T-easy/ELA2B。测序后与GenBank中的ELA2B基因序列进行比对。测序结果与GenBank上的序列完全一致。用EcoRI和Not I分别对pGEM T-easy/ELA2B和毕赤酵母表达载体pPIC9K进行双酶切，将弹性蛋白酶基因切下，转入到表达载体pPIC9K中，构建质粒pPIC9K/ELA2B。经过双酶切和测序验证，证明插入方向正确且未引起碱基序列的变化。

用Sac I对表达载体pPIC9K/ELA2B进行线性化，用电转化方法，将质粒转入毕赤酵母GS115中，利用MD培养基筛选到近460个转化子，再经G418抗性的二次筛选，获得50株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子。采用酪蛋白-MM平板诱导的方法，成功筛选出高效分泌表达的重组菌株。