[发明专利]一种利用血清痕量基因组DNA进行HLA基因分型的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种以血清为样本，利用血清痕量基因组DNA进行HLA基因分型的方法，特别涉及应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)从血清痕量基因组DNA中进行人类白细胞抗原I类分子(HLA-I)HLA-A2、A11和A24基因分型的方法。

背景技术：

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因是位于人类第6号染色体短臂上的一组紧密连锁的基因群。这些基因编码产物不但决定着宿主的组织相容性，而且参与宿主的免疫应答和免疫调节。如，直接影响乙型肝炎病毒(HBV)感染患者的感染类型等。

传统HLA抗原分型方法是微量淋巴细胞毒试验，其误差率较高，而且成本昂贵，需要昂贵的流式细胞仪等专门仪器和特异性抗体而限制其应用。因个体HLA遗传学差异的本质是在编码其抗原产物的基因水平上，所以HLA基因分型是HLA抗原分型最准确的方法。目前常用的有3种：(1)序列特异性引物(PCR-SSP)分型；(2)序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)分型；(3)测序分型。

但是这三种基因分型方法均需要受试者新鲜抗凝全血作为检测样本，或者从受试者分离出来的外周血单个核细胞(PBMC)中提取获得，样本较难获得和保存。而相比而言，血清是相对容易获得的标本，但血清中基因组DNA含量非常低，作为检测分型的样本，有很大的技术难度，对灵敏度和特异性要求相当高。

如果能够克服技术难点，从血清中残存的痕量基因组DNA中进行PCR为基础的分型，将极大增加HLA抗原分型的便利。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用血清为样本，利用血清痕量基因组DNA进行HLA-A分型的方法。

本发明提供了一种从血清提取痕量DNA，运用巢式PCR方法进行HLA-A2，A11，A24基因型分型的方法。

本发明的技术方案如下：

一种以血清为样本进行HLA基因分型的方法，其特征是：将血清裂解释放DNA，乙醇沉淀提取DNA，应用序列特异性引物巢式PCR方法扩增出HLA基因外显子2和外显子3的DNA序列进行HLA基因分型；其中，外引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，内引物具有SEQ ID NO：3～NO：8所示的核苷酸序列；且在PCR反应时，加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。

所述裂解可采用少量血清用异硫氰酸胍/LiCl2裂解释放DNA；

所述扩增前，调整内外引物的浓度，能够克服低模板对扩增效率带来的不利影响，用少量血清(100μl)中残留的痕量基因组DNA就可以实现HLA-A分型的目的。第一轮内外引物浓度5倍稀释，终浓度为20nmol/L；第二轮内外引物浓度不稀释，终浓度为100nmol/L。

为达到更好的效果，本发明在PCR反应液体系预先加入橙黄G，可免除常规电泳时另外加上样缓冲液的步骤，对PCR反应无任何干扰，使得对PCR产物的鉴定简便省时。

在PCR反应体系中以体积比1∶10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶，既提高了扩增的特异性，降低了错配率，又显著降低了成本(Pfu/Taq酶混合物的成本约为进口高保真耐热DNA耐合酶的1/10，而反应效率基本一致)。

本发明在HLA-A基因内含子区设计了通用的第一轮引物，然后利用HLA-A基因型间不同单核苷酸多态性设计不同的3’末端特异性引物，不同的基因型设计不同长度的PCR产物片段，并且把个别HLA-A基因型放在同一PCR管中进行分型，然后利用琼脂糖凝胶电泳分析不同的基因型。

本发明的有益效果是：

1、灵敏度高：样本用量少，仅100μl血清便可获得HLA-A型特异性的目的片段。

2、准确率高：体系中加入Pfu DNA聚合酶与普通Taq酶，既能达到校正功能，又可减少成本，可进一步降低错配率。

1)经与PCR产物直接测序法(金标准)比较，符合率达到98.1％(见实施例2)，而传统的血清学流式分型方法与PCR产物直接测序法(金标准)比较，符合率为91.1％。

2)和传统血清型HLA低分辨率分型(Hurley CK，et al.The relationship betweenHLA-B45 and B*5002 in the five major U.S.population groups[J].Tissue Antigens，2000，55(4)：352-358)相比，本发明的分型方法错配率小于2％。