[发明专利]一种HLA基因分型的PCR-SBT方法及其试剂

说明书

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法及其试剂，尤其涉及一种用于HLA-A、B、C位点1-7外显子基因分型的分子生物学检测方法及其试剂。

背景技术

人类白细胞抗原（HLA）基因位于第6号染色体短臂21.3区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA抗原与同种器官移植的排斥反应密切相关，器官移植术后移植物能否存活很大程度上取决于供者与受者之间HLA型别是否相合。HLA位点分型对选择合适的供体、降低移植物抗宿主病（GVHD）的发生率、提高移植物的存活率均有重要意义。

HLA-A、-B、-C座位基因为经典的HLA-Ⅰ类基因，具有高度遗传多态性，广泛表达在各种有核细胞表面。编码HLA-HLA-A、-B、-C的基因具有相似的基因结构，一般含有7个内含子和8个外显子，其大小约为3.5kb。第1外显子编码前导链，第2、3、4外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，第5外显子编码连接多肽和跨膜区蛋白，第6、7、8外显子分别编码胞内区域和非翻译区蛋白。HLA-A、-B、-C的多态性主要由编码α1、α2区的第2、3外显子决定，但是在第1、4、5、6、7外显子上也有一定的多态性。

HLA分型技术已广泛应用于多个领域，如HLA多态性的研究、HLA的生物学功能、器官和骨髓移植前供受者组织相容性配型、HLA与某些疾病的关联、亲子鉴定以及人类遗传学等方面。HLA的分型技术主要有血清学分型技术、细胞学分型技术、基因分型技术等。个体HLA遗传学差异的本质在于编码其抗原产物的基因上，所以分析个体HLA的基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清学与细胞学分型。目前以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法和细胞学分型技术。基因分型方法具有独特的优点：需要的血样少，标本可长期保存，相应的分型试剂可大量制备，来源不受限制。特别重要的是基因分型精确可靠，重复性好，其分型错误率远低于血清学方法，基因分型技术已在实际工作中得到了广泛的应用。

HLA的基因分型方法基本上可分为两种类型。一类是以鉴别HLA基因序列不同为基础的HLA分型技术，如序列特异性引物PCR（polymerase chain reaction sequence specific primer, PCR-SSP）、序列特异性寡核苷酸探针分型技术（polymerase chain reaction  sequence specific oligonucleotide  probe, PCR-SSO）、单核苷酸序列分析（PCR sequence base-typing，PCR-SBT）、基因芯片、流式细胞术（Luminex）等。另一类基于不同HLA等位基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有不同的构象而设计的。实际工作中一般采用PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SBT、基因芯片、流式细胞术等技术，其中HLA分型的直接测序方法（PCR-SBT）是最准确的HLA分型方法，也是目前的金标准方法。但现阶段的HLA-A、B、C位点PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较集中的2、3、4号外显子的测定来确定其基因型，而对第1、5、6、7号外显子不进行测序，由于HLA高度遗传多态性，在第1、5、6、7外显子上也有一定的多态性，因此现有的方法测定2-4外显子多态性，可能引起部分等位基因无法指定，存在歧义或错误的结果，严重影响临床工作。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种HLA基因分型的PCR-SBT方法，以克服现有HLA-A、B、C位点分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案： 它对HLA-A位点1-7外显子、HLA-B位点1-7外显子、HLA-C位点1-7外显子进行基因分型，包括以下步骤：

（1）、制备人基因组DNA；

（2）、设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HLA-A、HLA-C位点基因外显子1-8全长序列和HLA-B位点基因外显子1-7全长序列；

（3）、将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；

（4）、设计测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；

（5）、将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

（6）、将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。