[发明专利]一种提高猪体细胞核移植效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高体细胞核移植效率的方法，尤其是一种通过Calyculin A预处理供体细胞，提高猪体细胞核移植效率的方法，属于繁殖或授精方法领域。

背景技术

自从克隆羊“Dolly”诞生以来，体细胞核移植技术先后在多种哺乳动物上取得成功，但克隆效率依然很低，平均在0.1％-2.0％之间。为提高核移植效率，研究人员在核移植技术程序、卵母细胞成熟质量、体外胚胎培养条件、供核细胞的筛选和预处理等方面进行了大量的研究，虽然取得了一定进展，但核移植胚胎发育到期率仍然很低(Li，J.，Du，Y.，et al.ChemicallyAssisted Handmade Enucleation of Porcine Oocytes，2006 Cloning Stem Cells 8：241-50；Furnus，C.C.，Matos，D.G.，et al.Metabolic requirements associated with GSH synthesis during in vitromaturation of cattle oocytes，2007 Anim.Reprod.Sci.doi：10.1016/j.anireprosci.2007.12.003.)。

目前认为克隆效率低下的最主要原因就是体细胞核重编程不完全。体细胞核重编程是指供体细胞核移入卵母细胞后停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的特定基因表达程序。这个过程主要是对供体细胞表观遗传修饰进行重新编写，其中包括染色体重塑、DNA甲基化重建、组蛋白修饰改变和印记基因表达调控等。体细胞核移植过程中，卵母细胞必须对供体核进行重编程，消除其组织特异的表观遗传修饰，不能有效地消除组织特异的表观遗传修饰以及重建胚胎的表观遗传模式将影响胚胎的正常发育。因此解决体细胞核表观遗传重编程不完全问题将有助于提高核移植效率。

一般认为，在核移植过程中，体细胞核的表观遗传修饰通常是在合子基因组激活前很短的时间内被去除，然后重新建立的，可见1-细胞期发生的事件对细胞核表观遗传模式的重建尤为重要(Zuccotti，M.，Garagna，S.，Redi，C.A.Nuclear transfer，genome reprogramming andnovel opportunities in cell therapy，2000 J Endocrinol Invest.23：623-9.)。一般来说，体外受精胚胎在全程发育能力上远远高于核移植胚胎，因此可以通过比较1-细胞期卵胞质对供体细胞核和配子核重编程过程的差异，来推测体细胞核表观遗传重编程不完全问题的关键所在。在正常受精胚胎发育过程中，受精后高度凝集和高甲基化的配子核经历了染色质结构、DNA甲基化、组蛋白修饰等的动态变化，发生去甲基化，解凝集形成雌、雄原核，这些变化在建立早期胚胎的表观遗传修饰模式，激活早期胚胎发育所需的全能基因表达方面发挥重要作用。然而，在核移植过程中，供体细胞核在刚进入卵胞质中后，会在成熟促进因子(MPF)的作用 下发生核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(PCC)，但由于核质互作不充分或MPF活性较低，导致PCC不彻底或不发生，供体核甲基化不完全。激活后，随着MPF活性的降低，供体核解凝集形成类原核，与之相伴的是供体核的不完全去甲基化。由此可见，供体核进入卵胞质中后，凝集的不彻底或不发生，以及甲基化的不完全是体细胞核后续表观遗传重编程不充分的起因和关键。这些异常可能导致体细胞自身组织特异性基因的持续表达，早期胚胎发育相关多能性基因(如Oct4)过早或不能激活和表达，还可能引起印记基因异常表观遗传修饰和表达。换言之，如果体细胞核能像精子核和卵子核一样，在重编程之前处于高度凝集和高甲基化的状态可能有利于提高核移植效率。