[发明专利]一种泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种泥蚶线粒体cytochrome c oxidase subunit I(COI)基因扩增引物的筛选方法。

背景技术

泥蚶(Tegillarca granosa)俗称血蚶，属软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲(Lanellibranchia)，列齿目(Taxodonta)，蚶科(Arcidae)，泥蚶属(TegillarcaIredale)，是一种生活在潮间带泥质沉积区的双壳贝类，在全国沿海各省市均有分布。

泥蚶作为四大养殖贝类之一，肉味鲜美，可鲜食，也可制成干品，蚶肉富含蛋白质和维生素。泥蚶作为大众化的海鲜品，在我国河北、山东、南方各省市均有人工养殖，产量颇丰。关于泥蚶人工育苗、繁殖与生长、生理生化等方面的研究已有较多报道，但是基于分子标记的遗传多样性的研究开展较少，这种现状极大的阻碍了对泥蚶种质资源的开发利用和保护。线粒体脱氧核糖核酸(Mitochondrial DNA，即mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中性进化等特性，在分子遗传学研究中发挥着重要作用。其中，COI基因作为进化速率相对较快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用。由于Folmer(1994)设计的通用引物COIL1490和COIH2198在泥蚶中扩增结果不理想，即琼脂糖凝胶电泳检测大部分个体无扩增条带，以往应用线粒体COI基因对泥蚶的遗传分化研究采用了克隆测序的方法。这种方法虽能得到较精确的测序结果，但费时费力，且成本很高，不适合大规模的泥蚶群体遗传学研究。开发适用性好的COI基因扩增引物可有效的解决这些问题，同时为泥蚶的资源保护和利用、多样性评估、遗传育种等方面奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，它能满足现有技术的上述需求。

一种泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载已有的泥蚶线粒体COI序列；b、将下载的序列用BioEdit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件PrimerPremier 5设计多对引物，送交上海生工生物技术有限公司合成；d、将泥蚶个体提取DNA，然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物COINF和COINR：COINF为5’TTGATAGGGATCTGTTTAAGA3’；COINR为5’GCCAATACAGGCAAAGAAA3’。

本发明筛选出一对用于扩增泥蚶线粒体部分COI序列的引物COINF和COINR，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具有条带单

一、扩增效率高(＞90％)的特点，能够满足泥蚶遗传多样性研究的需要。

具体实施方式

实施本发明的泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法时，分以下五步：

a、登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载已有的39条泥蚶线粒体COI序列(Genbank登录号为：EF583524-583540和FJ411459-411480)。

b、用序列处理软件BioEdit(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)对上述序列进行多重比对分析，确定出前后端较保守区域。

c、经比对后在前后端各100个碱基对的较保守区域内，用引物设计软件Primer Premier 5(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html)设计引物，设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。设计的多对引物交由上海生工生物技术有限公司合成。

d、对采自山东威海和福建霞浦的泥蚶(个体数均为15个，共30个)用苯酚-氯仿法提取DNA，加双蒸水稀释为100ng/μl的工作液备用。

e、在10μl PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这30个泥蚶个体的COI片段，该体系包括：100ng模板DNA，0.25U Taq聚合酶(Takara)，1×PCR buffer，0.2mM dNTPs，1.5mM Mgcl₂，引物各1μM。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性1min，52℃退火温度1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

本实验扩增出的产物用质量百分数浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一，扩增效率高的一对引物COINF和COINR：该引物的产物片段长度约500bp，28个个体有明亮条带，扩增效率大于90％。用ABI PRISM 3130测序仪(Applied Biosystems)双向测序。序列用BioEdi t软件拼接后，和NCBI上下载的39条泥蚶COI序列进行多重比对分析，确定所得序列为泥蚶线粒体COI序列。