[发明专利]口蹄疫病毒样颗粒及制备方法和用途

说明书

技术领域

发明涉及一种亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒，以及这种病毒样颗粒的制备方法和用途。

背景技术

口蹄疫是危害我国主要畜种猪、牛、羊最严重的疫病。这些畜种创值占畜牧业产值的80％左右，该病造成的经济损失每年达数百亿元，又涉及食品安全和公共卫生。我国十分重视对该病的防控，对推动农业产业结构调整，加快“三农”发展意义重大。

加入WTO后，发达国家通过对畜牧业产品的技术壁垒手段，限制我国活畜及其产品的出口，畜牧业的外贸出口损失巨大。目前使用的灭活疫苗防控已不能适应当前国际贸易形势，大大影响了我国动物及其产品的出口，严重限制畜牧业对畜牧业的健康发展和对国民经济的贡献度。因此，研究和创制具有自主知识产权的口蹄疫新型疫苗制剂是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。

中国发明专利200710008843.6公开了“含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒与制备方法及应用”，该专利采用了原核表达系统，且其病毒样颗粒是噬菌体外壳蛋白包裹口蹄疫病毒的IRES RNA。即外壳是噬菌体外壳蛋白而非口蹄疫外壳蛋白。口蹄疫病毒的IRES RNA是指口蹄疫病毒基因组非编码区的其中一小段。该病毒样颗粒主要用途是想做为检测RNA病毒时的标准参照品。

发明内容

本发明的目的是提供一种亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒，同时本发明提供这种病毒样颗粒的制备方法及用途。

本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒是由亚洲I型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的基因序列为SEQ 1，其中VP3的基因序列为SEQ 3，其中VP1的基因序列为SEQ 2。

本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒的制备方法是：

(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA的构建：

a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F/smt3R为引物扩增得到smt3基因，引物序列如下：

上游引物smt3F：5’GCCATGG_(Nco I)GT CAT CAC CAT CAT CAT CAC_(6×His)GGG TCG GACTCA GAA GTC AAT CAA 3’，

下洲引物smt3R：5’GGA TCC_(BamH I)GAGACC_(Bsa I)TTAA GGTCTC_(Bsa I)AA CCT CCA ATCTGT TCG CGG TG 3’，

b.经Nco I和BamH I双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄抗性基因，得载体pSMA；

(2)亚洲I型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1基因的扩增：通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以亚洲I型(Asia I)口蹄疫病毒RNA为模板，分别用引物VP0BsmBI/VP0BamH I、VP3BsmB I/VP3BamH I和VP1BsmB I/VP1BamH I扩增获得VP0，VP3和VP1基因。

引物序列如下：

上游引物VP0BsmBI：5’GTA CTT CGTCTC AAGGT GGA GCC GGG CAA TCC AGT，

下游引物VP0BamH I：5’GCG AGT GGA TCC TCA CTC TTT CGA GGG CAG TTC，

上游引物VP3BsmB I：5’GGA CTT CGTCTCA AGGT GGG ATA GTT CCT GTG GCG，

下游引物VP3BamH I：5’GCT TAT GGA TCC TCA CTG TTG GCG GGC ATC CAC；

上游引物VP1BsmB I：5’GCA CTT CGTCTCA AGGT ACT ACC ACC ACT GGC GAG，

下游引物VP1BamH I：5’GCG CAC GGA TCC TCA CAG AGT CTG TTT CTC AGG；

(3)重组表达载体的构建