[发明专利]口蹄疫病毒样颗粒及制备方法和用途

权利要求书

1.亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于由亚洲I型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的基因序列为SEQ 1，VP3的基因序列为SEQ 3，VP1的基因序列为SEQ 2。

2.权利要求1所述的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒的制备方法，其特征是：

(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA的构建：

a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F/smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：

上游引物smt3F：5’GCCATGG_(Nco I)GT CAT CAC CAT CAT CAT CAC_(6×His)GGG TCG GAC TCA GAA GTC AAT CAA 3’，

下游引物smt3R：5’GGA TCC_(BamH I)GAGACC_(Bsa I)TTAA GGTCTC_(Bsa I)AA CCTCCA ATC TGT TCG CGG TG 3’，

b.经Nco I和BamH I双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄抗性基因，得载体pSMA；

(2)亚洲I型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1基因的扩增：通过反转录聚合酶链式反应，以亚洲I型口蹄疫病毒RNA为模板，分别用引物VP0BsmBI/VP0BamH I、VP3BsmB I/VP3BamH I和VP1BsmB I/VP1BamH I扩增获得VP0，VP3和VP1基因。

引物序列如下：

上游引物VP0BsmBI：5’GTA CTT CGTCTC AAGGT GGA GCC GGG CAA TCCAGT，

下游引物VP0BamH I：5’GCG AGT GGA TCC TCA CTC TTT CGA GGG CAGTTC，

上游引物VP3BsmB I：5’GGA CTT CGTCTCA AGGT GGG ATA GTT CCT GTGGCG，

下游引物VP3BamH I：5’GCT TAT GGA TCC TCA CTG TTG GCG GGC ATCCAC；

上游引物VP1BsmB I：5’GCA CTT CGTCTCA AGGT ACT ACC ACC ACT GGCGAG，

下游引物VP1BamH I：5’GCG CAC GGA TCC TCA CAG AGT CTG TTT CTCAGG；

(3)重组表达载体的构建

将经BsmB I/BamH I双酶切后的VP0、VP3和VP1分别插入经Bsa I酶切处理的pSMK，pSMA和pSMK，得到重组表达载体pSMK/VP0，pSMA/VP3和pSMK/VP1；

(4)双表达重组载体的构建

以pSMK/VP1为模板，以T7BamH I/VP1Xho I为引物扩增获得含有T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamH I/Xho I双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，得双表达重组载体pSMK/VP0-VP1，引物序列如下：

上游引物T7BamH I：5’GCA ATT GGA TCC CGT CCG GCG TAG AGG ATCGA，

下游引物VP1Xho I：5’GCG CAC CTC GAG TCA CAG AGT CTG TTT CTCAGG；

(5)蛋白表达与纯化

将pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL株(Stratagene)，用氯霉素、青霉素和卡那霉素筛选三抗性克隆进行蛋白表达和纯化；

(6)口蹄疫病毒样颗粒的体外组装：

用小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白，通过HisTrap HP除去小泛素样修饰蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的液体，用透析缓冲液PBS(pH 7.5)透析组装成目的病毒样颗粒。

3.权利要求1所述的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒在制备亚洲I型口蹄疫疫苗的应用。