[发明专利]一种检测猪细小病毒的双抗体夹心ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备，多克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测猪细小病毒方法的建立。

背景技术

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。PPV最早是从培养细胞中发现并分离得到的一种小DNA病毒，我国于20世纪80年代初在不同地区分离到PPV，并查明其为造成母猪繁殖障碍的主要病原体之一。PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为4个类型。研究表明，PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，而且能够引起多种猪病，PPV感染主要引起胚胎和胎儿死亡、流产、木乃伊等而母体通常不表现临床症状，此外PPV还与非化脓性心肌炎、皮炎、肠炎及病毒血症等有关，近年来有许多猪细小病毒和圆环病毒(PCV)、繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)混合感染的报道。PPV能加重猪圆环病毒(PCV)引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。PPV在世界各地广泛存在，给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV基因组为单股负链DNA，大小约为5000bp，基因组有两个主要的开放阅读框架，基因组共编码3种结构蛋白和两种非结构蛋白，即VP1、VP2、VP3和NS1、NS2。VP2蛋白是主要的免疫原性蛋白，可以诱导机体产生强烈的免疫反应，NS1蛋白是PPV基因组本身编码的反式激活蛋白，对PPV早期和晚期的转录发挥着重要作用，另外有研究表明，NS1蛋白是具有多种功能的锚定蛋白，在PPV体外感染过程中具有重要功能。随着对猪细小病毒研究的不断深入，目前已经在猪细小病毒感染的病原学、诊断与防制等方面取得了进展。

双抗体夹心法是检测抗原的最常用方法，操作步骤如下：

1)将特异性抗体与固相载体联接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质；

2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗体抗原复合物。洗涤除去未结合的抗原物质；

3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关；

4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于建立一种可以直接、快速、准确地检测猪细小病毒的检测方法。

本发明所说的双抗体夹心ELISA检测猪细小病毒方法，是兔抗猪细小病毒IgG作为一抗包板，鼠抗猪细小病毒单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记后作为二抗，夹心法检测猪细小病毒病毒抗原。

本发明方法中所说的鼠抗猪细小病毒单克隆抗体，其制备方法是：杂交瘤的准备，用于免疫BALB/c小鼠，收集该免疫小鼠的腹水，进行脱脂纯化酶标。

本发明方法中所说的兔抗猪细小病毒IgG(PPV-IgG)，其制备方法是：猪细小病毒的繁殖，用于免疫荷兰大白兔，收集该免疫兔的血清，进行IgG纯化。

本发明方法中兔抗PPV-IgG最佳包被浓度为0.91μg/ml(即最佳稀释倍数为1∶12800)，酶标单抗的最佳稀释倍数为1∶16，用pH 9.6碳酸盐缓冲液做为包被缓冲液，37℃包被1.5h，含8％犊牛血清的PBST为封闭剂，37℃封闭2h。样品37℃作用1.5h，用含4％犊牛血清的PBST稀释的酶标单抗，37℃作用1h，TMB做为显色剂，37℃避光显色10min。用PBST做为洗涤剂，每次5min。

本发明双抗体夹心ELISA检测猪细小病毒的方法检测结果的判定标准为A450≥0.445时结果判为阳性，否则为阴性。

本发明的优点是使用辣根过氧化物酶标记单抗，这样大大减少了检测时间，提高了检测的灵敏度和特异性。

附图说明

图1是3C5酶标抗体层析图谱；

图2是3C5交联物各管全波长图示；

图3是PPV与单抗的Dot-ELISA结果；

图4是Dot-ELISA特异性检测；

其中，P为阳性对照，N为阴性对照，1～4分别为CPV、HCV、PCV1、PCV2；

图5是阴性对照；

图6是代号278的细胞病变；

图7是代号519的细胞病变。

具体实施方式

一.试验方法

1抗原的制备

1.1病毒的培养及繁殖