[发明专利]非组织培养的玉米遗传转化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种非组织培养的玉米遗传转化方法，属于基因工程技术领域。

背景技术：

玉米既是重要的饲料和粮食作物，也是极其重要的工业原料作物。目前全球玉米产量稳步增长，但随着经济的快速发展和人民生活水平的迅速提高，玉米消费总量则持续增加，供求矛盾加剧。通过常规育种进行玉米的遗传改良是现在玉米增产的主要途径之一，但有限的遗传资源和比较长的育种周期等因素往往限制了其应用的潜力。

转基因技术可以打破物种界限，对基因进行定向改造和重组，对品种的抗性、品质、产量等性状进行协调改良，在缓解资源约束、保障粮食安全和保护生态环境等方面具有重要的价值。

建立良好的遗传转化体系是基因转化能否成功的关键因素之一。目前较常用且转化效率较高的是农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法。

目前，人们已经能从多种外植体如幼胚(Armstrong等，1985；Hayashi等，1998；Danilova等，2004；潘光堂等，2006；宋芸等，2006)、成熟胚(郭丽红等，1999；Huang等，2004)、花药(Genovesi等，1982；Martin等，1992；李新华，2005)、雌雄幼穗(张玉玲，1999；付凤玲等，1999)、雄幼穗的颖片(Suprasanna等，1986)、茎节切段(Andrew等，2001)、根尖(Li等，2004；Zhang等，2002)、幼苗叶片(Ahmadabadi等，2006)等诱导出愈伤组织，有的不但能诱导出愈伤组织，而且还成功获得了再生植株。但玉米的遗传转化仍然十分困难，没有一套完整的被广泛使用的转化体系，尤其在国内。

基因型是影响遗传转化的一个重要因素(Hodges等，1986；梁竹清，1986；Gutsulyak等，1994；潘光堂等，2006；Lozovaya等，2006)。目前，玉米植株再生能力较好的基因型仍只限于模式自交系A188和B73及其衍生系、美国杂交种78599选育的后代、墨西哥甜玉米等。

发明内容：

本发明的目的是提供一种非组织培养的玉米遗传转化方法，通过建立一个适合多种玉米品种的遗传转化体系，该体系以玉米幼胚为外植体，经农杆菌侵染后直接长出抗性植株，不需组织培养过程，转化频率平均为1％以上，达到建立一个操作简便、适应性广的玉米遗传转化体系的目的。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

非组织培养的玉米遗传转化方法，该方法包括如下步骤：

(1)剥取玉米幼胚；

(2)制备农杆菌菌液；

(3)侵染与共培养：将步骤(1)中得到的玉米幼胚浸泡于步骤(2)中制备好的农杆菌菌液中，100-150W超声波处理20min后，接种于Murashige和Skoog固体培养基，24℃条件下暗培养共培养3d；

(4)转基因植株生长：将步骤(3)培养的玉米幼胚用无菌水清洗2-3次，接种于含头孢霉素150mg/L的Murashige和Skoog固体培养基，26℃条件下暗培养1周，移栽到营养基质中，在温室中培育；

(5)转基因植株的检测：采用PCR或Southern杂交鉴别玉米转基因植株。

所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，步骤(1)所述的剥取玉米幼胚的方法是：取授粉11-13d的玉米幼穗，用75％酒精浸泡1min，0.1％HgCl₂水溶液消毒10min，无菌水冲洗5次后，剥取幼胚，幼胚长2～3mm。

所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，步骤(2)所述的制备农杆菌菌液的方法是，取农杆菌100μL接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜，取100μl该培养液接种于100ml同样的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于含100uM乙酰丁香酮的Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.6。

所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，步骤(4)中所述的营养基质是指蛭石∶草炭土∶消毒田园土＝1∶1∶1，加入磷酸二铵2kg/m3。

有益效果：

1.适应范围广，本发明的非组织培养的玉米遗传转化方法适用于多种玉米品种，而现有的遗传转化体系只适用于少量玉米品种。