[发明专利]富集肺癌细胞复合纳米微球的制备

说明书

技术领域

本发明属于高分子化学和细胞生物医学领域，特别涉及一种结合肺癌细胞的复合Fe₃O₄磁性纳米颗粒及其制备方法，以及一种富集和检测痰液中肺癌细胞的方法。

背景技术

肺癌居十大恶性肿瘤之首，具有“三高”现象：发病率高、死亡率高、上升幅度高；是影响人类健康的主要疾病，与爱滋病并列成为21世纪主要医学问题之一。凭借目前诊断肺癌的手段，一旦发现和确诊是肺癌，基本上处于中晚期，尚难以获得有效的控制。因此，实现肺癌的早期诊断是实现早期治疗的长期未能破解的国际医学难题。

痰液细胞病理学检查是目前极有希望开发推广为早期诊断肺癌的最有效的方法。目前存在的最主要问题是：1、痰液送检费时费力；2、假阴性率高(20～40％)，原因在于：痰液制片手工操作而导致细胞丢失(标本不能全部取用)、涂片的质量太差(不均匀、过厚，过多的黏液、血液或炎细胞遮盖了不正常的细胞、细胞形态保存不佳)，细胞成分复杂(大量脱落上皮细胞、炎症细胞)，脱落肺癌细胞散在，分布不均。

所以，必须去除无关细胞，才能做到低成本地连续检测，大幅度提高阳性率。因此，肺癌细胞分离富集是实现肺癌早期诊断这个国际性难题首先要解决的问题。如果能够寻找到一种比较简便实用的方法将肺癌细胞从痰液中分离出来富集，早期治疗肺癌就有希望。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对痰液中细胞成分复杂，检测痰液中肺癌脱落细胞假阴性率高的缺陷，提供一种结合肺癌细胞的复合Fe₃O₄磁性纳米颗粒及其制备方法，和一种检测痰液中肺癌细胞的方法。该方法检测痰液中肺癌细胞具有较高的阳性率。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种结合肺癌细胞的复合Fe₃O₄磁性纳米颗粒，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA(葡萄球菌A蛋白)和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。所述的抗CD44抗体优选兔抗人CD44，抗CK7抗体优选兔抗人CK7。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种如上所述的结合肺癌细胞的复合Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒；

2)在步骤1)所得的Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺；

3)在步骤2)所得的聚乙酰亚胺修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面标记对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白，该复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。

本发明中，步骤1)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒的方法可以本领域常规方法，较佳的采用共沉淀法。更佳的步骤1)具体包括：将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4∶1的比例于乙醇中形成分散均匀的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0.5～1.0mol/L；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用去离子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝胶进行400℃下退火处理即制得Fe₃O₄沉淀；将制得的Fe₃O₄沉淀依次用去离子水和乙醇交替清洗，至pH值为中性，真空干燥，即得Fe₃O₄磁性纳米颗粒。步骤1)所述的Fe₃O₄磁性纳米颗粒的平均粒径范围较佳的是15～50nm，更佳的是20nm。