[发明专利]富集肺癌细胞复合纳米微球的制备

权利要求书

1.一种结合肺癌细胞的复合Fe₃O₄磁性纳米颗粒，其特征在于，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。

2.一种如权利要求1所述的结合肺癌细胞的复合Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒；

2)在步骤1)所得的Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺；

3)在步骤2)所得的聚乙酰亚胺修饰的Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面标记对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白，该复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的Fe₃O₄磁性纳米颗粒的平均粒径范围是15～50nm。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)包括：将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4∶1的比例于乙醇中形成分散均匀的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0.5～1.0mol/L；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用去离子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝胶进行400℃下退火处理即制得Fe₃O₄沉淀；将制得的Fe₃O₄沉淀依次用去离子水和乙醇交替清洗，至pH值为中性，真空干燥，即得Fe₃O₄磁性纳米颗粒；

步骤2)包括：

将Fe₃O₄磁性纳米颗粒置于PBS缓冲溶液中，超声分散，缓慢加入聚乙酰亚胺(PEI)，慢速充分搅拌均匀后，移至恒温水浴上继续慢速搅拌24小时，水浴温度保持30℃；

用磁分离法将固体从溶液中分离，将固体依次用蒸馏水和甲醇交替清洗至pH值为中性，真空干燥，即得PEI修饰的Fe₃O₄纳米粒子；

步骤3)包括：

将聚乙酰亚胺修饰的Fe₃O₄纳米粒子悬浮于0.01M pH7.2TBS之中，得纳米粒子溶液，其中聚乙酰亚胺修饰的Fe₃O₄纳米粒子的浓度约为3×10¹³个/ml；

用0.01M pH7.2TBS分别溶解蛋白A和蛋白B，混匀，4℃反应30分钟，即得复合蛋白溶液，其中，蛋白A浓度为10mg/ml，蛋白B浓度为1mg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗CD44抗体和/或抗CK7抗体；

将上述复合蛋白溶液与上述纳米粒子溶液均匀混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。

5.一种富集痰液中肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)采集痰液，充分液化痰液；

b)在步骤a)所得的液化痰液中加入如权利要求1所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；

c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞。

6.一种检测痰液中肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)采集痰液，充分液化痰液；

b)在步骤a)所得的液化痰液中加入如权利要求1所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；

c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞，将所得细胞重新悬浮，然后采用液基薄层细胞学检测系统将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤a)所述的痰液中加入碱性裂解液以充分液化痰液，所述的碱性裂解液：1％蛋白酶K，10％NaOH的水溶液。

8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的反应是室温静置15分钟。

9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤c)所述的离心是500rpm，5分钟；离心所得的细胞悬浮在保存液中，保存液是：10％甲醇水溶液。