[发明专利]一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于特异性检测致手足口病肠道病毒的组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth disease)是由肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等。个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。

可以起手足口病的肠道病毒有多种亚型，包括柯萨奇病毒(Cox)A5、A10、A16、A19型及肠道病毒71型(Ev71型)。20世纪70年代以前，cox A16型肠道病毒被认为是引起手足口病的主要病原(何家鑫，沈晓娜。海峡预防医学杂志，2001，7(3)22-24)。日本曾经多次发生手足口病暴发流行，其主要病原为cox A16型肠道病毒。我国天津在1983-1986年，也曾发生由cox A16型肠道病毒引起的手足口病暴发流行。20世纪70年代初，美国首先发现由Ev71型肠道病毒引起的手足口病。澳大利亚和日本也陆续观察到由Ev71型肠道病毒引起的手足口病的流行，一些Ev71型重症病例伴有中枢神经系统症状(李显，汪华。江苏卫生保健，2002，4(4)：178-180)。根据世界各国手足口报道的情况来看，Ev71型和cox A16型肠道病毒是引起手足口病的主要病原(Tan EL，Chow VT，Quak SH，Yeo WC，Poh CL.Diagn Microbiol Infect Dis.2008Jul；61(3)：294-301)。

手足口病的地区分布极为广泛，欧洲、北美洲、大洋洲和亚洲国家，均有暴发流行。一般多在夏秋季节爆发，健康带毒者和轻型散发病例是主要的传染源，主要通过飞沫经呼吸道传播和被污染的玩具、手经口传播，而大部分人群对致手足口病的肠道病毒普遍易感，尤其是婴幼儿，更易感染，因而托幼中心和小学是手足口病高发区。2008年，安徽阜阳上千名儿童感染肠道病毒EV71，引起手足口病暴发，仅3月份，就有19名患儿抢救无效死亡。全国其他省市，也不同程度的出现手足口病的暴发流行。其中，北京(2221例)、上海(1988例)、广东(13189例)、浙江(5132例)、江苏(2479例)、山东(1985例)、湖北(1424例)、河南(1385例)等省市报告病例数均超过千例。由于目前缺乏特异、高效的手足口病抗病毒药物，对症和支持治疗是手足口病的主要治疗措施。而加强实验室监测和提高监测敏感性是控制手足口病暴发流行的关键。

随着分子生物学技术的快速发展，在病原微生物实验室和临床检测中，PCR法由于其快速、简便和特异性强的特点，逐渐呈现出要替代病原培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而相比普通PCR方法，real-time PCR更加省时，特异更强，灵敏度更高，同时无需PCR后产物分析步骤，减少了实验操作步骤，降低了实验室污染的风险，展现出了更大的应用前景。

根据行业标准，我国目前致手足口肠道病毒的检测主要依靠普通RT-PCR。一般耗时要4-6个小时。根据PubMed查询的结果，以“Hand-foot-mouth disease real-time pcr”为查询关键词，国外仅有6篇相关的文献报道。因而，根据我国致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒基因序列特征，建立一种快速简便的多重real-time PCR，在一个反应中，实现鉴别检测致手足口病的EV71和Cox A16型两种肠道病毒，可以显著提高手足口病检测效率和检测的灵敏性，同时简化检测过程，节约人力、物力和相关的检测成本。由于在一个反应中同时检测多种类型的病毒，需要考虑多对引物、探针之间是否存在交叉干扰、错配以及退火温度是否匹配等因素，并非是将分别检测各种病毒用引物等简单的组合在一起即可实现；目前尚没有可以在一个反应中同时检测EV71和CoxA16型两种肠道病毒的产品或方法。

发明内容

本发明的主要目的就是针对上述问题，提供一种可用于特异性检测致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒的组合物；利用该组合物，可在一个反应中同时检测致手足口病的EV71和Cox A16型两种肠道病毒，从而显著提高手足口病检测效率和检测的灵敏性，同时简化检测过程，节约人力、物力和相关的检测成本。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述组合物的试剂盒。

本发明的又一个目的是提供一种利用上述组合物或者试剂盒特异性检测致手足口病肠道病毒的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：