[发明专利]一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，其特征在于：

该组合物中包括下列引物：

P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，

P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中还包括下列探针：

Probe1：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，

Probe2：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为ECLIPSE。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中还包括下列引物：

P3：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，

P4：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；

P5：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，

P6：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中还包括下列探针：

Probe3：5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′，

Probe4：5′-荧光基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；

并且在二个探针中分别使用不同的荧光基团。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述的二对荧光基团和荧光淬灭基团分别为：HEX和ECLIPSE；Cy5和BHQ3。

7.含有权利要求1-6中任一项所述的组合物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有RT-PCR反应体系。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应体系为实时定量PCR反应体系；反应体系为20μl，5×PCR缓冲液4μl、10mmol/LdNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1ul，加灭菌水至终体系20μl。

9.利用权利要求1-6中任一项所述的组合物、或者利用权利要求7或8所述的试剂盒，检测致手足口病肠道病毒的方法，包括下述主要步骤：

(1)、提取RNA：提取样品中的肠道病毒RNA；

(2)、real-time PCR反应：以上述步骤(1)提取得到的样品中的肠道病毒RNA为模板，使用所述的组合物或试剂盒，用real-time PCR法扩增EV71和Cox A16型肠道病毒特异性基因片断；

(3)、结果分析：对上述步骤(2)real-time PCR反应的结果进行分析，得出检测结论。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述的real-time PCR法的循环参数为：

50℃，逆转录30min；95℃，10min；进入循环阶段：95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。