[发明专利]一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病检测方法技术领域，具体的讲是一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)，俗称鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类感染性疾病综合症。1878年，在意大利鸡群中首次发现该病毒。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。现在该病几乎遍布世界各地，对世界养禽业的发展，甚至对人类的健康都造成了严重威胁。禽流感特别是H5和H7亚型高致病性禽流感(HPAI)已经被国际兽医局(OIE)定为A类烈性传染病，曾在历史上造成过巨大的灾难。和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明的优势还在于进行检测的同时可以对禽流感病毒进行分型。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法。它的技术方案为：

一、设计并合成禽流感病毒的通用型和亚型特异性探针，并进行氨基化修饰；

二、将氨基化修饰探针通过化学交联方法偶联至不同的微球；

三、合成禽流感病毒通用型和不同亚型的特异性引物，并进行生物素化修饰；

四、提取待测样本RNA，在包含所述引物的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到样本cDNA；

五、将cDNA高温或加入变性液使之变性；

六、将变性cDNA与杂交液加入包含氨基化修饰的微球溶液中，进行杂交反应；

七、再将量子点标记的链酶亲和素交联液加入反应，后通过流式微球技术检测，判断待测样本是否含有禽流感病毒以及确定病毒的分型。

该发明的优点是：(1)通量高：目前有100种微球可供研究使用。(2)检测所需样本量少，本技术只需1μL的PCR产物进行检测。(3)快速：本技术对单个微球进行检测，不存在本底影响，基本上不需洗涤，因此所需时间短。(4)可靠性高：本技术是对多个荧光信号进行单独检测后，用配套软件进行统计分析。是结果更加精确、可靠。(5)重复性好：不同种类的微球进行标记后混合，分成小份用于检测个标本，各小份性质完全一致。

具体实施方式

本发明的检测步骤如下：

1.微球-氨基化探针偶联：

取1.25×10⁶个微球为一批次，在1.5mL离心管中，将微球置换到MES缓冲液(MES，0.1M，pH4.5)中，加入优化量的氨基化探针，加入一定量的EDC溶液，避光振摇常温反应0.5小时，再加入等量的EDC溶液，避光振摇常温反应0.5小时，用Tween 20和SDS溶液洗涤微球。最后，用pH8.0的TE溶液储存微球-氨基化探针偶联物。

2.RT-PCR扩增：

提取待测样本RNA，在包含禽流感病毒通用型和不同亚型的生物素化特异性引物的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到样本cDNA；

3.cDNA变性：

将cDNA高温或加入变性液使之变性；

4.微球-氨基化探针-变性cDNA-量子点标记链酶亲和素复合物的形成：

在96孔滤膜板中，同时加入微球-氨基化探针偶联物、变性cDNA，与杂交液室温避光振摇反应2-3小时，进行杂交反应，抽滤掉板上孔中反应液，其中多余的变性cDNA随反应液被抽滤掉，与微球-氨基化探针偶联物结合的变性cDNA留在孔中；然后加入量子点标记链酶亲和素，室温避光振摇反应0.5-1小时，量子点标记链酶亲和素与孔中变性cDNA特异性结合，形成微球-氨基化探针-变性cDNA-量子点标记链酶亲和素复合体。

5.荧光检测：

将96孔滤膜板上孔内溶液转移至管中上流式细胞仪进行检测，该检测方法的测定原理是通过检测结合到微球上的氨基化探针-变性cDNA-量子点标记链酶亲和素复合体的荧光强度实现对待侧物的检测。检测标本的同时，将空白PCR产物作为正常对照。计算正常对照平均荧光强度的均值，将标本平均荧光强度与之比较并计算比率。

以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发明做任何限制。凡依照本发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的范围之内。