[发明专利]一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法

权利要求书

1.一种基于流式荧光编码微球技术的用于禽流感病毒多亚型同步检测的RT-PCR一流式微球检测方法，其特征在于：以具有功能化基团的聚苯乙烯荧光编码微球作为固相载体，将禽流感病毒亚型特异性探针以形成共价键方式包被到固相载体上，形成微球-包被探针偶联物，与不同亚型禽流感病毒生物素标记引物扩增获得的RT-PCR产物发生特异性反应，再与量子点标记的链酶亲和素反应，使用流式分析系统对反应产物中逐一通过检测区的微球所负载的多种荧光信号进行检测，通过与阴性样本对比，判断样本是否为阳性。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：微球-包被探针偶联物的形成过程，在96孔滤膜板内的微球-包被探针偶联物的体系中加入带有生物素的待测病毒的RT-PCR产物，进行杂交反应，RT-PCR产物再与量子点标记链酶亲和素特异性结合而形成基于微球的荧光杂交复合体。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：基于微球的荧光杂交复合体的形成是以量子点作为荧光标记物，用量子点标记链酶亲和素，加入的微球-包被探针偶联物、带有生物素的待测病毒RT-PCR产物反应完后，加入量子点标记链酶亲和素反应形成微球-包被探针偶联物-病毒RT-PCR产物-量子点标记链酶亲和素的荧光杂交复合体。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：根据内部包埋荧光染料比例的不同对微球进行编码，不同的荧光编码微球连接不同亚型禽流感病毒的探针，加入病毒RT-PCR产物，可同步检测同一样品中多型禽流感病毒，或者同步检测多个样品中不同型禽流感病毒。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所说的用流式系统对逐一流过检测区的微球所负载的荧光信号进行检测，是指检测系统的两束激光光源发射波长分别为488nm和635nm，一束通过判定微球内包埋的染料比例从而对待测物进行种类定性分析，另一束通过测定微球上反应连接的荧光探针强度从而判断待测物含量多少。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于定性检测使用阴性、阳性对照样本为参照，根据待测病毒的平均荧光强度比率来定性，平均荧光强度比率大于或等于阴性检测值的2.1倍时为阳性，小于时为阴性。