[发明专利]一种提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法。更具体地说，本发明涉及水稻种子贮藏蛋白之一的谷蛋白GluA-2的信号肽编码序列以及利用该序列的研究与应用，将该序列与目标蛋白融合，可明显地提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中的表达量。本发明属于生物基因工程领域。

背景技术

利用转基因技术在植物中表达异源基因，以提高抗逆性、增加产量和改善品质等已成为现代农业生物技术研究开发的重点与热点。尤其是近年来，利用植物这一廉价生产系统作为生物反应器，来大量生产重组的编码具重要功能的异源蛋白、医用活性多肽或疫苗、抗体、工业用酶或蛋白质等，是目前植物基因工程发展的一个重要领域之一，其研究与开发方兴未艾，有可能形成一个低投入、高产出的新兴生物技术产业。但是，在植物生物反应器研究中存在一个较为突出的问题，即目标蛋白的表达量极低，某些蛋白还不能稳定积累下来，如在转基因植物中表达的重组抗原的量一般只占总可溶性蛋白的0.01-1％。因此，建立高效稳定的新型植物生物反应器技术体系历来是该领域研究的重点与难点。细胞代谢合成的蛋白质在植物与动物中贮存的方式有所不同；因此，要实现重组蛋白(尤其是一些非植物来源的目标蛋白)在转基因植物细胞中高效表达与稳定积累，需要遵循与植物本身蛋白一致的表达与贮存规律。除了对目标蛋白编码基因的密码子进行修改外，另一关键技术，便是要应用受体植物来源的基因表达调控元件和目标蛋白靶向序列。其中，使用组织特异性表达基因的启动子及其相关靶向调控元件，尤其是种子特异性表达基因的启动子及其氨基-端(N-端)的信号肽编码序列，被认为是实现目标蛋白在植物特定的组织中高效表达的有效途径。

种子贮藏蛋白是水稻种子中仅次于淀粉的一种富含成分，其编码基因的表达往往具有极严格的组织与时空特异性，而且还含有特定的蛋白靶向调控元件。这些基因在翻译形成蛋白前体时，其氨基末端都含有一段信号肽(signal peptide，SP)序列，长度随贮藏蛋白种类的不同而有所不同，它们在贮藏蛋白及其mRNA分子的定位及运输中起重要作用。在贮藏蛋白基因转录出成熟的mRNA后，首先翻译形成含信号肽的前体蛋白，此时该前体蛋白由信号肽序列牵引定向地转移到粗糙型内质网腔内，随后这一信号肽序列从前体蛋白上被剪除下来，以便贮藏蛋白能正确地加工(Coleman等1995)。除了在目标蛋白的正确定向中具有决定作用外，信号肽序列在调控基因表达水平上也具有重要的作用(Boehm等2000)。信号肽序列的上些特性已在转基因植物研究中获得了很好的应用。例如，利用菜豆肌动蛋白内质网特异的信号肽序列可明显增强大肠杆菌辅酶Q在转基因烟草中的转录与随后的表达量。由此可见，贮藏蛋白的信号肽序列对于在转基因植物中外源蛋白的表达与沉积是有积极作用的。

谷蛋白是水稻胚乳中最主要的贮藏蛋白，它一般在种子发育的中后期大量合成并积累(Yamagata等1982)。虽然它与豆科植物中的11S球蛋白的溶解性能完全不同，但它们在氨基酸组成、蛋白质结构及其合成途径上有许多相似之处(Zhao等1983，Wen和Luthe 1985)，因此有时将水稻谷蛋白也归为植物的球蛋白大家族中。水稻种子中含有三种不同分子量的谷蛋白，分别为57KDa的前体谷蛋白、37-39KDa的酸性亚基(具酸性等电点)和20-22KDa的碱性亚基(具碱性等电点)，其中的酸性亚基和碱性亚基是由谷蛋白前体经翻译后加工剪切而成(Yamagata等1982)。成熟的谷蛋白都是异质性的，如谷蛋白酸性亚基至少由12个多肽组成，而碱性亚基也至少含有9个多肽(Wen和Luthe 1985)。根据谷蛋白的氨基酸序列，可将其分为A和B两个大的亚家族(Sub-family，分别简称为GluA和GluB)，每一个亚家族中都由多基因控制；GluA或GluB内各多肽间氨基酸序列的同源性在80-88％之间，而两类不同亚家族间多肽的氨基酸序列同源性却不到65％(Takaiwa等1991)。从谷蛋白基因或其cDNA推导的氨基酸序列分析，在谷蛋白前体的氨基末端(N-端)有一个很典型的由24个氨基酸残基组成的信号肽，该信号肽序列在引导谷蛋白前体定位于内质网膜上，并进而转运到内质网膜腔内的过程中起重要作用(Okita等1989，Takaiwa等1991)。